PCR（聚合酶链式反应）是分子生物学的一项基石技术，广泛用于基因克隆、诊断检测和研究。虽然它快速、高效且高度特异性，但即使是经验丰富的研究人员有时也会遇到可能影响实验结果的细微陷阱。为了帮助您排除故障并优化 PCR 实验，我们整理了这份免费指南，其中包含您可能未考虑过的 5 个基本技巧。通过微调这些小细节，您将看到更好的结果、更高的产量和更少的非特异性扩增。
PCR原理
了解 PCR：基础知识
PCR 的核心 通过重复一系列温度驱动的步骤来扩增特定的 DNA 片段： 变性、退火和延伸。通过这些循环，DNA 聚合酶合成新的 DNA 链，每次循环 DNA 量加倍。经过足够数量的循环后，您的目标 DNA 片段即可被检测到。
PCR 产量通常遵循指数增长曲线，DNA 在每个循环中加倍，直到达到稳定期。标准 PCR 公式为：
PCR 产物产量 = 2^N 拷贝 （其中 N 是循环次数）。
然而，随着循环次数的增加，Taq 聚合酶、dNTP 和引物等试剂 被消耗，并且副产品会积累，导致停滞。
PCR扩增曲线
理解和优化该曲线是获得高质量 PCR 结果的关键。
1.调整 您的 PCR 循环条件
优化 PCR 最关键的步骤之一是调整循环参数。
陷阱 1：循环次数太少
如果您没有运行足够的循环，尤其是在模板浓度较低的情况下，您的目标 DNA 可能无法充分扩增。通常，建议进行 30-40 个循环以实现稳健扩增。如果您的模板稀疏，请不要害怕选择此范围的较高值。
陷阱 2：循环次数过多
虽然增加循环次数以提高产量似乎很有吸引力，但过度循环可能导致非特异性扩增和假阳性。反应通常在 25-35 个循环后达到最大产量，之后进入稳定期，产物不会显着增加。
提示：为了避免这种情况，请使用高性能 PCR 试剂，如 Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR 预混液 （Cat# 10167ES），可减少反应停滞并在仅 30-35 个循环内实现高产量。
图1：10167扩增576bp大肠杆菌菌落，基因来源于拟南芥，扩增效果优于竞争产品，延伸时间为30秒/kb，扩增34个循环。
2.完善你的引物设计
引物设计是任何 PCR 实验的基础，这里的小错误可能会破坏整个反应。
陷阱 1：忽略 3' 端构图
虽然许多研究人员关注 GC 含量和引物长度，但引物的 3' 端是一个重要的考虑因素。理想情况下，最后几个碱基应该是 G 或 C，以增加引物-模板结合稳定性并减少错误引导或错配。
陷阱2：引物浓度不正确
如果引物浓度过高，则会增加引物二聚体或非特异性结合的可能性。相反，如果浓度过低，则可能无法实现足够的扩增。最佳最终引物浓度通常在 0.4 至 0.5 μM 之间。
提示：正向和反向引物的浓度应保持在 0.4-0.5 μM 左右，这是 Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR 预混液 套件。一致性可确保更少的错误和更可靠的结果。
| 成分 | 容量 (μL) | 容量 (μL) | 最终浓度 |
| 2×希夫® 超快速 II 热启动 PCR 预混液* | 二十五 | 12.5 | 1× |
| 模板** | 十 | 十 | - |
| 正向引物 F（10 μM）*** | 2 | 1 | 0.4-0.5 μM |
| 反向引物 R （10 μM） | 2 | 1 | 0.4-0.5 μM |
| 氢键2哦 | 最多 50 | 最多 25 | - |
3. 注意模板 DNA 的质量和数量
模板 DNA 在 PCR 反应中起着关键作用，质量或浓度问题可能会导致扩增不良。
陷阱1：模板DNA降解
DNA 会随时间而降解，尤其是在储存不当的情况下。确保定期测试模板的浓度，尤其是储存时间较长的情况下。在开始实验之前务必重新量化 DNA，以确保结果准确。
陷阱2：不正确的模板处理技术
对于某些生物体（例如酵母），模板制备可能会带来重大改变。例如，在处理酵母时，将细胞煮沸 5 分钟，然后在 -80°C 下冷冻 3 分钟，然后再解冻，可以大大提高 PCR 产量。
10167ES 酵母扩增
提示：始终使用新鲜制备且定量良好的模板 DNA。如果您使用的是更难处理的模板（如酵母），请考虑优化提取方案以获得更好的结果。
4. 避免试剂受到污染
试剂污染通常是 PCR 失败的一个被忽视的原因。这包括移液器的物理污染和试剂之间的交叉污染。
陷阱1：试剂交叉污染
PCR 试剂（如引物）通常会经历多次冻融循环，这会增加污染风险。务必始终将引物作为反应的最后组分之一添加，以最大程度地降低这种风险。
陷阱2：非特异性扩增
如果引物没有按照正确的顺序添加，或者每个步骤之间没有更换移液器吸头，则可能会发生反应之间的交叉污染，从而导致非特异性扩增。
提示：按照最佳顺序添加试剂：水 → 引物 → 模板 → PCR Mix 酶。这有助于避免污染问题，并使您的反应保持清洁可靠。
5. 选择正确的 PCR 混合物和添加剂
并非所有 PCR 混合物都是一样的，选择正确的 PCR 混合物会对实验的成功产生重大影响。
陷阱 1：使用劣质 PCR 混合物
某些 PCR 混合物在处理复杂模板或高 GC 含量时效果较差。对于具有挑战性的反应，请考虑使用专为快速高效扩增而设计的高性能混合物。
提示：我们建议使用 Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR 主混合物（目录号 10167ES），可提供更快的延伸时间和更佳的复杂模板处理性能。其处理高 GC 含量和大片段的能力无与伦比，可在更短的时间内为您提供更高的产量。
性能演示
- 快速有效的菌落扩增
图 1：大肠杆菌菌落的极限延伸时间扩增试验。 对于3kb以内的片段，10167ES的延伸效率可达1秒/kb，对于6kb片段的延伸效率为3秒/kb，对于6-10kb片段，效率可达5秒/kb。M:10,000 DNA Marker (10505ES)。
- 长片段、高GC菌液的快速高效扩增
图 2： 长片段和高 GC 菌液扩增表明 10167ES 产量更高，检测率达 100%，优于竞争产品。M：10,000 DNA Marker（10505ES）。10167ES的延伸速度为10秒/kb，而竞争产品则需要15秒/kb。
结论：细节决定成败
优化 PCR 不仅仅是一步一步地遵循实验方案，还在于了解微小的变化如何显著改善您的结果。从微调循环条件到确保试剂质量，关注这些细节可能会成就或破坏您的 PCR 实验。
通过花时间优化您的方案并使用正确的试剂，例如 Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR 预混液，您可以显著提高 PCR 效率和产量。请记住，在 PCR 领域，细节决定成败。
准备好改善您的 PCR 结果了吗？立即探索我们的产品， Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR 预混液 将您的研究提升至新的水平！
关于 Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix
这款新一代 PCR 混合物专为快速、高效和高产扩增而设计。无论您处理的是细菌菌落、难处理的模板还是高 GC 含量，此混合物都可以帮助您以更少的时间和更少的循环获得最佳结果。
Fast PCR Master Mix升级版
2×希夫® 超快速 II 热启动 PCR 预混液
快速、高效、消除停滞、提高产量
| 产品定位 | 姓名 | 目录编号 | 规格 |
| 升级快速PCR，适用于细菌PCR和复杂模板扩增 | 2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR 预混液 | 1毫升/5×1毫升 | |
| 最快5分钟一步克隆1-7个片段。 | Hieff Clone® Universal II 一步式克隆试剂盒 | 20吨/50吨 |
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