第 1 章：PCR 技术
1.1 PCR 原理
PCR（聚合酶链式反应）即聚合酶链式反应，是指 DNA 聚合酶 以DNA母链为模板， 特异性引物 为了延长起点，添加 dNTP、Mg2+ 和 延伸因子，扩增增强 因素。 通过变性、退火和延伸步骤， 子链在体外复制时与母链模板DNA互补，能在体外快速、特异地扩增任何目标DNA。
1.2 DNA 聚合酶的分类
DNA pol 是一种 重要的酶 蜂窝 DNA 复制。根据热稳定性、合成能力、速度、保真度和 特异性，可分为Taq DNA聚合酶，高保真DNA聚合酶，热启动DNA聚合酶，直接扩增DNA聚合酶，长片段化DNA聚合酶 酶、快速DNA聚合酶、多重DNA聚合酶等。
其中最常见的是 Taq DNA 聚合酶，它在 5'→3' 端具有聚合酶活性，并且 外切酶活性 5'→3' 端，但没有 3'→5'末端校正活性。Taq酶最重要的特点是耐热性好，能耐受热变性 步 PCR 的，因此不需要在中途添加更多的酶。 然而，Taq 的保真度较低，因为它没有校对活动。它的保真度 主要通过镁离子与dNTP的浓度和比例来实现。
高保真DNA聚合酶含有一个聚合中心和一个切割中心，聚合中心具有5'→3'DNA聚合酶活性，可以催化 DNA 的合成 沿5'→3'方向；酶切中心具有3’→5’外切酶活性，可进行碱基错配的修复。因此，高保真DNA聚合酶除了具有Taq DNA聚合酶的特性外，还具有纠正活性，负责 切除 不匹配 核苷酸，从而保证了产品的准确性。
上图显示了 DNA 聚合酶的工作原理 [1]。
直接 PCR（Direct PCR）是一种 反应 使用未纯化的样本进行 PCR 扩增和动物 或植物组织直接扩增。 现在，
上图显示了直接 PCR 技术。
一个。 直接法：取少量样本直接加入PCR PCR 鉴定用 Master Mix；
B. 裂解方法： 样本取完后加入裂解液释放基因组，取少量裂解上清加入PCR Master Mix进行PCR鉴定。
1.3 常见问题及解决方法
| 麻烦 | 原因 | 解决方案 |
| 无放大带 | 电泳系统问题 | 解决核酸染料、凝胶浓度和电泳缓冲液的问题。 |
| 变性温度不准确 | PCR仪指示温度与实际温度是否一致？温度过高，酶会迅速 在最初几个循环中；如果太低，模板变性不完全。 | |
| 反应体系中蛋白酶、核酸酶污染 | 加入Taq酶前，反应体系应先加热至95°C，持续5-10分钟。 | |
| 磷韵律错误 | 使用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。 | |
| 模板含有杂质 | 特别是甲醛固定、石蜡包埋的组织中往往含有甲酸，导致DNA脱嘌呤，影响PCR结果。 | |
| 底漆劣化和失效 | 确认合成引物正确、纯化或由于不适当的储存条件而失活。 | |
| PCR 产物量较少 | 退火温度不合适 | 设计梯度PCR反应，优化退火温度，梯度为2度。 |
| DNA 模板中存在抑制剂 | 确保 DNA 模板是干净的。 | |
| 长时间变性 | 长时间变性会导致 DNA 聚合酶失活。 | |
| 延伸太短 | 延伸时间太短。以1kb/min为原则设置延伸时间。 | |
| DNA 模板量太低 | 增加 DNA 模板的数量。 | |
| 引物数量不足 | 增加系统中的引物含量。 | |
| PCR 循环次数不足 | 增加反应循环次数。 | |
| 多频段 | 引物特异性差 | 利用BLAST、Primer等引物设计软件检查引物特异性或重新设计引物。 |
| 循环次数过多 | 适当增加模板用量，减少循环次数。 | |
| 外源性 DNA 污染 | 确保清洁操作。 | |
| 模板数量过多 | 质粒DNA的量应<50ng，基因组DNA的量应<200ng。 | |
| 底漆过多 | 减少反应体系中的引物量。 | |
| 反应溶液混合不充分 | 确保反应缓冲液完全融化并充分混合。 | |
| 镁 高浓度 | 适当调整所用Mg的浓度。 | |
| 酶用量过高或酶质量差 | 减少酶的量或用其他来源代替。 | |
| 退火温度低，退火及延伸时间长 | 提高退火温度，减少变性和延伸时间，或设计梯度PCR反应，优化退火温度。 | |
| PCR 混合物本身的问题 | 如果是PCR premix，则可能是试剂本身质量问题，建议换批次或者其他品牌。 | |
| 尺寸不对 | 碳污染 | 使用新的试剂和枪头清洁工作台。 |
| 模板或引物使用不当 | 更换引物和模板。 | |
| 格基因型 | 对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。 |
第 2 章：核酸电泳
2.1 核酸电泳原理
带电粒子在电场作用下向与其电性质相反的电极移动，称为电泳。利用电场中的带电粒子 以不同的速度移动并实现分离的技术称为电泳。核酸电泳是一种 重要工具 用于核酸研究 并且是 技术的组成部分，例如 核酸探针、核酸扩增 和序列分析。核酸电泳通常是 执行 在琼脂糖或 聚丙烯酰胺凝胶。不同浓度的 琼脂糖和聚丙烯酰胺可以形成不同分子筛网孔大小的凝胶，可用于分离不同分子量的核酸片段。
2.2 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是从海藻中提取的线性聚合物。琼脂糖在缓冲溶液中加热融化成清澈透明的溶胶，然后倒入 放入明胶模具中凝固形成固体基质，称为凝胶，其密度取决于 琼脂糖的浓度。
琼脂糖 凝胶电泳是一种以琼脂糖为支持介质的电泳方法， 主要的区别在于 分析 原理和其他支持电泳的是它具有 双重角色 “分子筛”和“电泳”的结合。 凝胶被放置在 电场， 在下面 的行动 电场，带电 核酸迁移到 积极的 极 通过 网格 的 这 凝胶。 这 率 迁移受到 核酸分子、琼脂糖浓度、 施加的电压、电场、电泳缓冲液和嵌入染料的量。 经过适当的电泳时间s是 在下面 不同条件，不同大小、构象的核酸片段会位于凝胶上的不同位置，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶分离 用途广泛，常用于DNA切割凝胶回收、DNA分离以及用于支持DNA是否重组， 质粒等。无论质粒是否被切割，不同浓度的琼脂糖凝胶 可以与长度分开 200基点 到 50kb 的 脱氧核糖核酸 碎片。
2.3 实验方法
制作 胶水
以1%浓度为例：称取1g琼脂糖，倒入250ml锥形瓶中，加入100ml 0.5×TBE电泳缓冲液 搅拌均匀，放入微波炉煮熟，然后 自然干燥至60℃左右，加入适量核酸染料摇匀后倒入已配好的干净凝胶板中，双手拿梳子 垂直插入凝胶溶液中，等待 凝胶 自然冷却至完全凝固（25-30分钟）。
取下胶水制作梳
小心地将凝胶转移到电泳槽中（使用凝胶托盘或仅使用凝胶), 将样品孔侧置于负极，加入0.5×TBE 电泳缓冲液直至凝胶低于约1毫米。
添加 样本
加入10×上样缓冲液（上样 缓冲） DNA 样本， 混合均匀，然后缓慢地将样品混合物加入到b合并凝胶 井 用移液枪，每孔加入5-10 μL样本（不超过40 μL）。一般情况下，第一个孔加DNA marker，第二个孔加阳性对照（定义的DNA）， 和 第三个为阴性对照（试剂或水）， 和 应记录样品的顺序。
电泳
盖上 电泳槽，连接 电线、接通电源，设置电泳电压、电流 和时间 参数。一般来说， 电压不应超过5伏/厘米（长度指 电泳槽正负极距离）， 和 电泳时间一般为 15-30分钟。
电泳结束
消除 这 凝胶（不带凝胶托盘）并在紫外成像系统下成像，以获得清晰的电泳图像，然后对电泳图像进行编辑 使用图像编辑软件和 标签上应标明样品信息、日期和操作员。
2.4 常见问题及解决方法
| 麻烦 | 原因 | 解决方案 |
| 缺少目标带 | 小 DNA 从凝胶中流出 | 缩短电泳时间，降低电压，增加凝胶浓度。 |
| 分子量大小相似的 DNA 带不易区分 | 增加电泳时间以匹配最佳凝胶浓度。 | |
| 目标片段对于常规电泳来说太大。 | 通过脉冲凝胶电泳进行分析。 | |
| 无目的剪辑 | PCR过程出现故障，没有扩增出目标产物。 | |
| DNA 带模糊 | 过期的电泳缓冲液 | 电泳缓冲液多次使用后，会出现离子强度降低，PH值上升缓慢，冲洗能力减弱，从而影响电泳效果，所以建议经常更换电泳缓冲液。 |
| DNA降解 | 避免核酸酶污染。 | |
| 所用的电泳条件不适合电泳 | 电泳电压不宜超过20V/cm，温度<30℃；大链DNA电泳温度应<15℃；检查所用的电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。 | |
| 过度的 DNA 采样 | 减少凝胶中上采样的 DNA 量。 | |
| DNA 样本太咸 | 电泳前用乙醇沉淀去除多余的盐。 | |
| 蛋白质污染 | 电泳前用苯酚提取去除蛋白质。 | |
| 样品浓度过高 | 上样浓度应小于500ng/孔，浓度过高会影响电泳速度、跑样速度，造成拖沓、模糊。 | |
| 弱带或无带 | DNA 样本量不足 | 增加 DNA 摄取量 |
| DNA降解 | 避免 DNA 受到核酸酶污染 | |
| 核酸染料的光源不合适 | 根据核酸染料的说明书选择适当波长的光源。 | |
| 带状未分离 | 缺乏时间 | 增加电泳时间 |
| 凝胶浓度不正确 | 胶水浓度过高，导致分离阻力太大。 | |
| 样品中盐离子浓度过高 | 高浓度的盐离子会增加电泳电阻并阻止带分离，例如含有核酸内切酶缓冲液的消化样品。 | |
| 非特异性条带 | RNA污染 | 重新制备样品 |
| 样品间的污染 | 填充过程中更换枪头；避免体积 >40 μl 的样品溢出。 |
2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体、链式聚合催化剂N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵以及交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺发生化学反应形成的。丙烯酰胺单体在催化剂的作用下聚合形成长链 链，即 交联 经过 交联剂形成凝胶，凝胶的孔径由链长和交联度决定。孔径由链长和交联度决定。 交联度。 链长取决于 丙烯酰胺的浓度，通过调节丙烯酰胺与交联剂的比例可以改变聚合物的交联度。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于 分离 样本基于 差异 收费， 分子大小和形状 电泳样品. 它结合了分子筛和静电 ，其分辨能力比琼脂糖凝胶电泳高。 DNA 片段 仅相差 一个核苷酸 可以分开。
聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分析和制备长度小于 1 kb 的 DNA 片段。根据 的大小 需要分离的核酸片段， 凝胶 不同的 可以准备。
不同浓度丙烯酰胺与DNA的有效分离范围如下表所示：
| 浓度。 （%） | 有效分离范围 (bp) |
| 3.5 | 100 至 2000 |
| 5 | 80 至 500 |
| 8 | 60 至 400 |
| 12 | 40 至 200 |
| 15 | 25 至 150 |
| 20 | 10 至 100 |
2.4 相关产品选择指南
常规 PCR | ||||
| 规格 | 10167ES | 10102ES | 10103ES | 10108ES |
| 扩增长度 | ≤10-15 千字节 | ≤5kb | ≤5kb | ≤4kb |
| 延长时间 | 1-10 秒/kb | 30 秒/kb | 30 秒/kb | 30 秒/kb |
| 产品最终结构 | 3'-dA | 3'-dA | 3'-dA | 3'-dA |
| 退火温度 | 60℃ | 温度-(2~5)℃ | 温度-(2~5)℃ | 温度-(2~5)℃ |
| GC 兼容范围 | 30-70% | 40-70% | 40-70% | 30-70% |
| 5'-3' 核酸外切酶活性 | 展示 | 展示 | 展示 | 展示 |
| 菌落 PCR | 合适的 | 合适的 | 合适的 | 合适的 |
| 基因鉴定 | 合适的 | 合适的 | 合适的 | 合适的 |
| 多重PCR | 不宜 | 不宜 | 不宜 | 3-4 重 PCR |
| 电泳指示剂 | 紫红色 | 蓝色的 | 无色 | 蓝色的 |
| 热启动 | 热启动 | 非热启动 | 非热启动 | 热启动 |
| 预混料/套件 | 预混料 | 预混料 | 预混料 | 预混料 |
直接 PCR | ||||
| 规格 | 10185ES | 10188ES | 10187ES | |
| 产品类型 | 小鼠直接扩增 | 血液直接扩增 | 植物直接扩增 | |
| 扩增长度 | ≤1kb | ≤8kb | ≤1kb | |
| 延长时间 | 30秒/千字节 | ≤2 kb 时为 3-5 s/kb， | 60秒/千字节 | |
| ≤8 kb 时为 10 s/kb | ||||
| 样品裂解时间 | 15 分钟 | 0-3分钟 | 0-10 分钟 | |
| 产品最终结构 | 钝端 | 钝端 | 钝端 | |
| 退火温度 | 铊-(2~5)℃ | 铊-(1~2)℃ | 铊-(2~5)℃ | |
| GC 兼容范围 | 30-70% | 30-75% | 40-65％ | |
| 5'-3' 核酸外切酶活性 | √ | √ | √ | |
| 基因鉴定 | √ | √ | √ | |
| 多重PCR | 3-4 丛 | |||
| 直接样本扩增 | √ | √ | √ | |
| 电泳指示剂 | 蓝色的 | 无色 | 蓝色的 | |
| 热启动 | √ | √ | √ | |
| 预混料/套件 | 套件（含混合料） | 套件（含混合液 + 缓冲液） | 套件（含混合料） | |
| 适用生物 | 小鼠, 大鼠 | 人、小鼠、山羊、鸡、猪等。 | 大米、玉米、烟草、油菜籽、小麦、大豆等。 | |
| 适用组织/材料 | 尾巴、耳朵、脚趾（带肌肉）和其他器官 | 含有 EDTA、肝素、柠檬酸盐等的新鲜血液、冷藏（冷冻）血液、商用干血斑 | 幼叶、老叶、幼苗、幼茎 | |
| 示例输入 | 组织：5-10 毫克；尾部：1-5 毫米 | 全血：0.5%-20%， 干血斑：1 mm² | 叶：1-10毫米，种子：1-3毫米 | |
高保真 PCR | ||||
| 规格 | 10164ES | 10153ES | 10154ES | |
| 扩增长度 | ≤10 kb gDNA，≤10 kb cDNA，≤16 kb λDNA | ≤10 kb gDNA，≤10 kb cDNA，≤13 kb λDNA | ≤10 kb gDNA，≤10 kb cDNA，≤13 kb λDNA | |
| 延长时间 | 5秒/kb | 30 秒/kb | 30 秒/kb | |
| 保真度 (Taq) | 83× | 83× | 83× | |
| 产品最终结构 | 钝端 | 钝端 | 钝端 | |
| 退火温度 | 60℃ | 68℃ | 68℃ | |
| GC 兼容范围 | 20-80% | 30-60% | 30-60% | |
| 5'-3' 核酸外切酶活性 | 缺席的 | 缺席的 | 缺席的 | |
| 电泳指示剂 | 蓝色的 | 无色 | 蓝色的 | |
| 单酶/预混料 | 预混料 | 单酶 | 预混料 | |
| 宽容 | / | / | 血液、小鼠组织裂解物 | |
核酸电泳 | ||||
| 产品类别 | 货号 | 产品名称 | 应用 | |
| 琼脂糖 | 10208ES | 琼脂糖 | 常规核酸电泳 | |
| 10221ES | 高筛琼脂糖（PCR 级） | 适用于分离20 bp-800 bp的DNA片段，可与聚丙烯酰胺凝胶媲美 | ||
| 10226ES | 琼脂糖片 (0.5克/片） | 方便常规琼脂糖应用 | ||
| 核酸染料 | 10202ES | YeaRed 核酸凝胶染色剂（水中 10,000 倍） | 水溶性，光谱特性与 EB 相似，可在 300 nm 紫外光下激发 | |
| DNA 标记 | 10510ES | GoldBand 1 kb DNA 梯状图 | 250-12000 bp（13 条带） | |
| 10515ES | GoldBand 50 bp DNA 梯子 | 50-1000 bp（14 条带） | ||
| 10507ES | GoldBand 100bp DNA 梯状图 | 100-1500 bp（12 条带） | ||
| 10516ES | GoldBand 100 bp 加 DNA 梯子 | 100-3000 bp（14 条带） | ||
| 10517ES | GoldBand 200 bp DNA 梯子 | 200-5000 bp（12 条带） | ||
| 10518ES | GoldBand 500 bp DNA 梯子 | 500-5000 bp（8 条带） | ||
| 10501ES | GoldBand DL2000 DNA 标记 | 100-2000 bp（6 条带） | ||
| 10504ES | GoldBand DL5000 DNA 标记 | 100-5000 bp（9 条带） | ||
| 10505ES | GoldBand DL10,000 DNA 标记 | 100-10000 bp（10 条带） | ||
| 10511ES | GoldBand 全尺寸 DNA 梯状图 | 100-12000 bp（20 条带） | ||
| 10512ES | GoldBand DL15000 DNA 标记 | 250-15000 bp（7 条带） |
2.5 使用核酸电泳产品的出版物（P人工的)
[1] 罗建, 杨 Q、Zhang X 等。TFPI 是高毒性进化枝 2 C. difficile 的 TcdB 结肠隐窝受体。 Cell. 2022；185(6):980-994. e15. doi:10.1016/j.cell.2022.02.010（影响因子：41.584）
[2] Huang N, Chen H, Gong H, et al. SeHed，一种利用应激诱发过氧化氢的新型基因表达系统 ide 消除特性和抗衰老作用。信号转导和靶向治疗。2022, 7, 235。doi: 10.1038/s41392-022-01047-2.（影响因子：38.1）
[3] 张晨, 周斌, 顾锋, 等. 微肽PACMP抑制引起合成致死效应 通过降低 CtIP 和聚（ADP-核糖基化）。mol Cell。2022；82（7）：1297-1312.e8。doi:10.1016/j.molcel.2022.01.020（影响因子：17.970)
[4] Zhu M, Dai X. 改变的 (p)ppGpp 水平导致生长抑制，这是由于非最佳 资源配置 大肠杆菌。核酸研究。2019；47(9):4684-4693。doi:10。1093/nar/gkz211（影响因子：11.147）
[5] Rizwan HM,Zhimin L, HarsonowatiW 等。鉴定真菌病原体以控制采后 百香果 (Passiflora edulis) 的腐烂和多组学比较通路分析揭示 紫色更具抵抗力 nt 对病原体的抵抗力比黄色品种要高。《真菌学杂志》（巴塞尔）。2021；7（10）：879。2021 年 10 月 19 日发布。doi:10.3390/jof 7100879 (影响因子：5.816）
[6] LiT, Zhou B, Luo Z, et al. 纳米氧化铝颗粒的结构表征 具有广泛活性的中和纳米抗体 SARS-CoV-2 变体。Front Microbiol。2022；13:875840。2022 年 6 月 2 日发布。doi:10.3389/fmicb.2022。875840 (影响因子：5.640)
[7] Wang T, Ren D, Guo H, et al. CgSCD1 对黑色素的生物合成和致病性至关重要 炭疽菌 gloeosporioides。病原体。2020；9(2) :141。发表于 2020 年 2 月 20 日。doi:10.3390/pathogens9020141(IF:3.018) :141。发表于 2020 年 2 月 20 日。doi:10。3390/病原体9020141（影响因子：3.018）
[8] 吕燕, 李晓玲, 张红, 邹锋, 沈斌. 溴氰菊酯敏感和抗性细胞中的 circRNA 表达谱
pipiens pallens（双翅目：蚊科）。康普生化 Physiol B Biochem Mol Biol. 2022；261:110750. doi:10.1016 /j.cbpb.2022.110750（影响因子：2.231）
[9] Hu M, Dai X. 改变的 (p) ppGpp 抑制生长 水平是由于资源配置不优化造成的 大肠杆菌[J].核酸研究，2019,47(9): 4684-4693.(影响因子11.6)
[10] 郭琳, 杨伟, 黄倩, 等. 硒代半胱氨酸特异性质谱技术揭示组织特异性硒蛋白质组和候选硒蛋白[J]. 细胞化学 生物学, 2018, 25(11): 1380-1388. e4. (IF6.762)
2.6 使用 PCR 产物的出版物（部分）
[1] 王Y， 傅 Z， 李克斯， 等 等 细胞质 DNA传感 经过 堪萨斯州 复杂的 在 年龄 CD4+T细胞 细胞 增强 电视 细胞 艾克提瓦 化 和 与衰老相关的 自身免疫 炎症。 免疫。2021；54(4):632-647.e9。 道伊:10.1016/j.immu
ni.2021.02.003（影响因子：31.745）
[2] 杨X， 高 F， 张伟， 等 等 “星星” miR-34a 和 CXCR4 拮抗剂 基于 纳米复合材料 二进制是 合作 迁移处理 反对吨 转移性 胸部 癌症。J 控制 发布。2020；326：615-627。 doi:10.1016/j。 jconrel.2020.07.029（影响因子：7.727）
[3] QiaoY， 杜杰， 葛 R， 等 等。 样本 和 检测 微针 修补 为了 银屑病 微小RNA 生物标志物
分析 在 插页式 液体。肛门 Chem. 2022；94(14):5538-5545。 doi:10.1021/acs.analchem.1c04401（影响因子：6.986）
[4] 林 Q,叶X, 黄 Z， 等 等 石墨烯 氧化物基 抑制 的 非特异性 在 环介导 异硫氰酸 扩增不良 启用敏感 检测 环氧合酶2 信使核糖核酸 在 结直肠 癌症。肛门 Chem. 2019；91(24):15694-15702。 doi:10.1021/acs.analchem.9b03861（影响因子：6.350）
[5] 林 问， 黄 Z,叶X, 等 等 实验室 在 一个 管子： 隔离， 萃取， 和 是奥特马尔 放大 检测 的 外泌体 长的 非编码 核糖核酸 胃的 癌症。塔兰塔。 2021；225：122090。
doi:10.1016/j.tta.2021.122090（影响因子：6.057）
[6] 刘 C, 邹 克， 等 5-甲酰尿嘧啶 作为 一个 多功能 建筑 堵塞 在 生物传感器 设计[J]. 化学 整数 埃德 Engl. 2018 年 7 月 26 日;57(31):9689-9693.（影响因子：1.0000） 11.992）
[7] 王 米， 张 年代, 郑 克， 等 等 功能获得 穆塔特离子 Card14 的 导致 自发的 类似银屑病 皮肤 炎症通过 增强型 角质形成细胞 回应 白细胞介素-17A。 免疫。2018；49（1）：66-79.e5。
doi:10.1016/j.immuni.2018.05.012(IF:19.734）
[8] 张Y， 鼎 H，王X， 等 等 MK2 促进 Tfcp2l1 降解 通过 β-谷氨酰酪氨酸 泛素 升伊加塞 到 调节 老鼠 胚胎干细胞 细胞自我更新。 细胞 Rep. 2021；37(5):109949。 doi:10.1016/j.celrep.2021.109949 (影响因子：9.423)
[9] 林 Q,叶X,杨 B, 等 等 即时的 荧光 环介导 等溫 放大的化 测定 为了 迅速的 和 敏感的 检测 链球菌 解没食子酸杆菌亚种 加洛利特重症监护室 与...相关 结肠直肠 癌症[J].
分析 和 生物分析 化学，2019，411（26）： 6877-6887.（影响因子6.35）
[10] 林 Q,叶X, 黄 Z， 等 等 石墨烯 氧化物基 抑制 的 非特异性 在 环介导 异硫氰酸 扩增不良 启用敏感 检测 环氧合酶-2 信使核糖核酸 在 颜色克塔尔 癌症[J]. 分析 卡尔 化学，2019.（IF6.35）
引用：
[1] Loeb LA, Jr R. DNA聚合酶和人类疾病[J]. 自然评论遗传学。