常见问题

可能的原因

解决方案

阳性对照及待测样品均未出现条带。

PCR反应体系或反应条件不合适。

利用梯度PCR探索PCR的最佳反应条件。

PCR试剂储存不当会失去活性。

2×Mouse Direct PCR Mix 应保存于-20°C，使用过程中避免反复冻融，若频繁使用可短暂保存于4°C。

引物设计问题。

尝试重新设计引物进行检查。

阳性对照有目的条带，而待测样品无条带或条带较弱。

储存不当或长时间储存​​可能会导致试剂活性丧失。

使用新鲜试剂。

添加过量的组织裂解物。

增加反应体系，或减少裂解物的量。

样本裂解混合物保存不当或保存时间过长，DNA基因组已降解。

裂解物混合物可以在 4°C 下保存 2-3 天。尝试使用新鲜制备的裂解物混合物进行 PCR。

模板添加量不适合。

模板加入量优化在反应体系的1-10%范围内。

PCR 循环次数不足。

增加PCR循环数，最好为35-40个循环。由于模板的复杂性，PCR反应应比纯化的DNA模板多进行5-10个循环。

非特异性扩增

PCR 退火温度太低、循环次数、引物浓度或模板浓度过高。

增加PCR退火温度并减少PCR循环数、引物浓度或模板浓度。

PCR 引物不匹配。

重新设计 PCR 引物。

配制PCR反应体系时温度过高或配制完成后时间过长。

PCR反应体系的制备在低温下进行，制备完成后尽快进行PCR扩增反应。

阴性对照中出现目标条带

操作工具或试剂受到污染。

实验中的所有试剂或设备均应高压灭菌。操作时应小心轻柔，防止目标序列被吸入加样枪或从离心管中溅出。

样品之间的交叉污染。

每个采样器只用于一个样品；或者在取完一个样品后，将采样器边缘浸入2％次氯酸钠溶液中，反复冲洗，然后用干净的纸巾擦干残留物。