Ct值是荧光定量PCR中一个很重要的结果表征，用来计算基因表达量或者基因拷贝数的差异。那么，荧光定量中Ct值多少范围才算合理呢？如何保证Ct值在有效范围内呢？今天就让小易来为大家解答这个问题。
Ct值是什么？
在qPCR扩增过程中，Ct值是指扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值的扩增循环数（Cycle Threshold）。“C”代表Cycle，“T”代表Threshold。简单来说，Ct值就是qPCR中起始模板达到一定产物量所需的循环数，后面会进一步解释。
Ct值起什么作用？
1. 指数扩增、模板量和Ct值之间的关系
理想情况下，qPCR反应中基因以指数方式扩增，并在一定循环数内不断积累。扩增循环数与产物量的关系可以表示为：扩增产物量=起始模板量×(1+En)^循环数。然而，qPCR反应并不总是在理想状态下进行。当扩增产物量达到“一定产物量”时，此时的循环数即为Ct值，表示指数扩增的周期。Ct值与起始模板量的关系为：模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数呈线性关系，起始模板浓度越高，Ct值越低；起始模板浓度越低，Ct值越高。
2.扩增曲线、荧光阈值及一定的产物量
qPCR扩增产物的数量直接以荧光信号的形式表现出来，即扩增曲线。在PCR的早期，当扩增条件理想，循环数较少时，产物的积累很少，产生的荧光水平与背景荧光噪声无法明显区分。随后，荧光的产生进入指数期。在反应刚进入指数期的某一时刻，可以检测到PCR产物的数量，称为“一定产物量”，以此推断模板的初始含量。因此，与一定产物量相对应的荧光信号强度称为荧光阈值。
在PCR的后期，扩增曲线不再呈现指数扩增，进入线性期和平台期。
3.Ct值的重复性
当PCR循环数达到Ct值出现的循环数时，才刚刚进入真正的指数扩增阶段，此时微小的误差还未被放大，因此Ct值的重现性极好，这意味着无论是同一模板在不同时间扩增，还是在同一时间在不同管中扩增，得到的Ct值都保持恒定。
Ct 值的范围是多少？
1.扩增效率En
PCR扩增效率是指聚合酶将目标基因转化为扩增产物的效率。当一个DNA分子变成两个DNA分子时，扩增效率为100%。扩增效率通常用En表示。为了方便后续文章的分析，这里对影响扩增效率的因素做简单介绍。
| 影响因素 | 解释 | 判决 |
| A. PCR 抑制剂 | 1. 模板RNA可能含有抑制PCR反应的物质，例如蛋白质或去垢剂等。 2. 逆转录后得到的cDNA中可能含有高浓度的模板RNA和逆转录试剂的成分，这也可能会抑制后续的PCR。 | 1. 可以通过测量 A260/A280 和 A260/A230 比率或进行 RNA 电泳来评估是否存在污染。 2. 反转录后cDNA是否按一定比例稀释。 |
| B.引物设计不合理 | 底漆无法有效退火。 | 检查引物是否有二聚体或发夹结构，是否有错配；有时需要注意跨内含子的设计。 |
| C.反应程序不适宜 | 1. 引物无法有效退火。 2.DNA聚合酶活性未充分释放。 3、由于长时间高温，DNA聚合酶活性降低。 | 1. 退火温度高于引物的Tm值。 2.预变性时间太短。 3. 反应方案中每个阶段持续时间太长。 |
| D.试剂混合不充分或移液错误 | 反应体系中PCR反应组分局部浓度过高或者不均匀，导致PCR不能实现指数扩增。 | / |
| E.扩增子长度 | 扩增子长度太长，超过300个碱基对，导致扩增效率低。 | 检查扩增子长度是否在80个碱基对至300个碱基对之间。 |
| F.qPCR试剂的影响 | 试剂中 DNA 聚合酶浓度较低或缓冲液中离子浓度不理想会导致 Taq 酶无法达到其最大活性。 | 标准曲线用于测量引物的扩增效率。 |
2.Ct值范围
Ct值的范围是15-35，小于15的Ct值被认为处于基线阶段，没有达到荧光阈值。理想情况下，Ct值和模板初始拷贝数的对数呈线性关系，即标准曲线。利用标准曲线，在扩增效率为100%时，计算出定量单个基因拷贝的Ct值在35左右。如果Ct值大于35，理论上模板初始拷贝数小于1，可以认为没有统计学意义。
对于不同的基因，由于起始模板基因拷贝数以及扩增效率的不同，其Ct值范围也存在差异，因此需要建立该基因的标准曲线，来计算该基因的线性检测范围。
3.影响 Ct 值的因素
由扩增循环数与产物量的关系可知：扩增产物量=起始模板量×（1+En）^循环数，可见在理想条件下，起始模板量和En都会影响Ct值，模板质量或扩增效率的差异都可能导致Ct值过高或过低。
4. Ct值过高或过低
肖毅请教了我公司技术部的专家，对两类常见的Ct值问题的原因及解决方法进行了总结，希望对大家有所帮助。
| 问题 | 原因 | 解决方案 |
| Ct 值过高 | 模板浓度低或存在 PCR 抑制剂。 扩增效率低。 | 1.增加模板浓度；或增加RNA或cDNA的稀释比例；或重新制备模板。 2. 降低退火温度，或采用两步扩增方法；确保成分和体系充分混合；优化反应方案；或尝试更换试剂。 |
| Ct值过低 | 1. 模板浓度高 2. NTC（无模板控制）和NRC（无反向控制）中的污染 3. 引物设计不合适 | 1. 减少模板RNA的量；或以更高的比例稀释cDNA。 2. 重新更换所有试剂；或使用UDGase抗污染试剂。 3. 优化程序，避免非特异性扩增。 |
本次Ct值异常原因分析就到此结束，接下来小易将为您推荐一系列高性价比的产品，让您的实验数据更加精准可靠，快来挑选您中意的产品吧！
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