荧光定量PCR（qPCR）是实验室常用的技术，可应用于基因表达分析、基因分型、病原体检测、SNP分析等。qPCR操作简单，原理通俗易懂。现在面对一堆杂乱的数据，如何分析结果就成了一件令人头疼的事。今天小易就带你如何化繁为简，轻松获得可以发表在SCI期刊的数据！
qPCR常用的分析方法有相对定量和绝对定量，两种方法的选择应根据不同的实验设计而定。本期我们将重点介绍qPCR的一个常见应用——基因表达分析，其中一般选择相对定量方法。
实验设计
假设我们目前需要研究光诱导对拟南芥AtSUC2基因表达的影响，对照组为未经过任何处理的拟南芥植株，实验组为经过一定光诱导处理的植株，分别提取两组的RNA，逆转录得到cDNA，以此为模板，选取拟南芥GAPDH基因作为qPCR实验的内参。
需要设置的qPCR孔如下：
1） 负温度系数 (NTC) （无模板对照）用于验证PCR体系中是否存在污染。
2） 尼古丁替代疗法 （无逆转录）是指使用没有经过逆转录的RNA作为模板，作为gDNA污染的控制。
3） 内参基因 用于校正因样品初始浓度不同而引起的差异。
4）选择 对照样品 一般分为以下几类：
- 为了评估某种处理对基因表达的影响，未处理的样本被用作参考样本。
- 为了检测不同时间基因表达的差异，以时间0的样本作为参考样本。
- 为了比较不同组织之间基因表达的差异，任意选择一个组织作为参考样本。
这里需要注意的一点是，上面提到的每种材料都设置了3个PCR孔（1、2、3），这些是PCR重复，也称为技术重复，目的是消除操作误差，准确评估扩增效率。此外，还需要建立生物学重复，即在不同材料（不同时间、不同植株、不同批次、不同反应板）上做同样的实验，以校准生物学变异性，分析处理是否具有统计学意义。具体来说，实验组和对照组都需要至少两组拟南芥样品（A、B、C）进行处理，每组提取RNA，逆转录后进行qPCR，统计分析取3个生物学重复的平均值。
结果分析——ΔΔCt方法
ΔΔCt法的特点是单纯依靠Ct值进行计算，但前提是目的基因与内参基因的扩增效率要相对一致，均在90-110%范围内。
具体计算公式如下：
ΔCt = Ct（目标基因）-Ct（参考基因）
ΔΔCt = ΔCt（实验组）-ΔCt（对照组）
RQ = 2^(-ΔΔCt)
假设上述实验研究光诱导对拟南芥AtSUC2基因表达的影响，qPCR的结果如下：
在计算时，我们首先计算对照组2^-△Ct数据的平均值（如上图所示，为0.00116），然后将每一个2^-△Ct值除以这个平均值，得到2^-△△Ct的值，最后整理得到均值与标准差，可知实验组目的基因表达量相较于对照组提高了约9.73倍。
使用Graphpad软件绘制结果如下：
该软件的t检验计算出的P值为0.0024，小于0.05，表明差异具有统计学意义，结果可靠。
结果分析——双标准曲线法
实际应用中，由于目的基因与内参基因的扩增效率往往不同，需要重新设计引物、优化反应条件才能达到相同的扩增效率，但我们也可以选择更便捷的方法，即双标准曲线法。
这里我们先来了解一下绝对定量的分析方法，具体步骤是通过PCR扩增出目标片段，然后将目标片段插入克隆载体，提取重组质粒，测序确认无误后即可作为标准。可以使用Nanodrop等仪器测出质粒DNA的量，通过拷贝数换算公式将拷贝数换算成特定的质粒拷贝数。之后经过一系列的稀释后对DNA进行扩增，以标准拷贝数的对数为横轴，测得的Ct值为纵轴绘制标准曲线，根据未知样本的Ct值即可计算出其绝对拷贝数。
拷贝数计算公式：
拷贝数 = (质量÷相对分子质量) × 6.02 × 10^23
双标准曲线法是针对目标基因和内参基因分别构建标准样本，进行绝对定量，制作标准曲线，计算出未知样本的绝对拷贝数后再进行比较，准确性更高。
具体计算公式如下：
Q = 目标基因拷贝数/参考基因拷贝数
RQ = Q（实验）/Q（控制）
在上述研究光诱导对拟南芥AtSUC2基因表达影响的实验中，分别构建了AtSUC2和GAPDH的标准样品，并制作了以下标准曲线：
待测样本中目的基因与内参基因的Ct值如下：
计算时，首先将目的基因和内参基因的Ct值代入标准曲线的线性关系中，得到实验组和对照组中目的基因和内参基因的绝对拷贝数，然后利用公式Q=目的基因拷贝数/内参基因拷贝数，对目的基因的表达水平进行归一化。最后根据公式RQ=Q(实验)/Q(对照)计算出RQ为9.71，表明实验组目的基因表达水平比对照组高出9.71倍。
使用GraphPad软件绘制的结果如下：
该软件t检验计算出的P值为0.0008，小于0.05，表明差异具有统计学意义，结果可靠。
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