双管齐下，miRNA表达分析变得更容易

成熟的miRNA长度只有20nt左右，通常正向引物会覆盖其全长甚至有多余的部分，而反向引物则无处安放。目前市场上的解决方案是在逆转录时增加逆转录产物的长度，常用的方法包括加尾法和茎环法。

1. 简介
2. 产品推荐
3. 相关产品列表

1. 简介

微小RNA（miRNA）是由约70-90个碱基的发夹结构单链RNA前体经Dicer酶加工后生成的一类大小约为21-23个碱基的单链小RNA。miRNA主要特异性地与靶基因mRNA的3’端非编码区结合，调控转录后靶基因mRNA的翻译过程，从而阻断mRNA翻译、促使mRNA降解，导致蛋白质表达下降。miRNA的作用参与个体发育、组织分化、细胞增殖、细胞凋亡等多种心血管疾病的发生发展。

Figure 1. Schematic diagram of miRNA synthesis in vivo

图1. miRNA在体内合成示意图

Figure 2. miRNA synthesis by tailing method

图2. 加尾法合成miRNA

Figure 3. miRNA synthesis by the stem-loop method

图 3. 通过茎环方法合成 miRNA

加尾法是利用PolyA聚合酶为成熟的miRNA添加Poly(A)尾巴，以带有通用序列的Oligo-dT为反转录引物，合成与cDNA第一链对应的加长miRNA；茎环法是利用折叠成茎环结构的通用序列为引物，合成与加长miRNA对应的cDNA第一链，在后续的扩增过程中，茎环结构在合适的温度下打开并与相应的扩增引物结合。

表 1.尾部结构和茎环结构的比较

类别	尾矿	茎环结构
适用性	适合同时研究多个不同的 miRNA	适用于样本中少数miRNA的精确定量检测
优势	一次逆转录即可高通量检测多个 miRNA	逆转录一次只能检测一个miRNA，特异性强
系统	与参与的miRNA一起，在同一反应体系中高精度逆转录	内部涉及的miRNA在两个系统中分离并逆转录，容易出现错误
特异性	★★★★☆	★★★★★
敏感度	★★★★★	★★★★☆
时间	★★★★☆	★★★★★

2. 产品推荐

2.1 Yeasen miRNA尾部倒置定量组合（11148ES&11171ES）

Figure 4. 11148ES-Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit

图4.11148ES-Hifair™ miRNA第一链cDNA合成试剂盒

本试剂盒采用加尾法对miRNA第一链cDNA进行逆转录，产品中的2×Hifair™ miRNA RT buffer包含了miRNA加尾反应和逆转录反应所需的全部原料和引物，并经过精心优化，可保证miRNA 3’端poly(A)修饰和逆转录过程同时高效进行。

Figure 5. 11171ES -Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

图 5. 11171ES -Hieff™ miRNA 通用 qPCR SYBR 预混液

专为miRNA定量检测研发的新一代预混荧光定量PCR检测试剂，含有特制的ROX Passive Reference Dye，适用于所有qPCR仪器，无需在不同仪器上调整ROX浓度，只需在制备反应体系中加入引物和模板即可进行扩增。DNA聚合酶采用化学改造的热启动聚合酶，配合特殊的Buffer体系，使得反应特异性和灵敏度更高，可在更宽的范围内准确定量。

2.2 产品性能

2.2.1 兼容全平台qPCR仪器

Figure 6. Compatible results with different qPCR instruments

图 6. 不同 qPCR 仪器的兼容结果

以293T细胞总RNA为模板，采用Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Cat# 11148ES）进行逆转录。将获得的cDNA稀释10倍，然后使用Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11171ES）分别检测hsa-miR-let-7b-5p，hsa-miR-let-7c-5p和U6的内参基因。

2.2.2 检测率高，可达10 pg

Figure 7. Amplification plot

图 7. 扩增图

Figure 8. Amplification plot

图 8. 扩增图

以合成的hsa-miR-let-7e-5p（a）和293T细胞Total RNA（b）为模板，分别稀释成60拷贝～606拷贝（6个梯度）和10 pg～100 ng（5个梯度），用Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Cat# 11148ES）进行反转录，得到的cDNA用Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11171ES）检测hsa-miR-let-7e-5p基因表达情况。

2.2.3 特异性强，能够区分同一家族中miRNA之间的单碱基差异

Figure 9. Distinguish single base differences between miRNAs

图9. 区分miRNA之间的单碱基差异

人类hsa-let-7家族有多个miRNA，彼此之间几乎没有碱基差异，甚至仅有一个碱基差异。利用Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) 合成各Let-7亚型的miRNA（hsa-miR-let-7a~Let-7i，has-miR-98）逆转录为cDNA，使用Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) 用不同的引物分别扩增这些miRNA，使用公式2-ΔCT x 100%计算匹配率。结果显示可以有效区分亲缘关系较近的亚型家族成员。

2.2.4 优异的扩增效率

Figure 10. Amplification efficiency

图10. 扩增效率

Figure 11. Amplification efficiency

图 11. 扩增效率

以人293T细胞和小鼠肝脏Total RNA为模板，扩增miR-let-7b-5p、miR-let-7c-5p、miR-let-7e-5p、miR-let-7f-5p基因，结果显示与同类产品相比，Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)与Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)反应体系匹配性优异。

2.2.5 稳定性优良

Figure 12. Product stability analysis at 37℃ for 7 days

图12. 37℃7天产品稳定性分析

Figure 13. Analysis of results after 50 freeze-thaw cycles

图13. 50次冻融循环后结果分析

Figure 14. Stable analytical properties of the quantitative reaction system at different temperatures for 24h

图14 定量反应体系在不同温度下24h稳定分析特性

以293T细胞Total RNA为模板，使用Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Cat# 11148ES）进行逆转录，所得cDNA稀释10倍后，使用Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11171ES）进行检测，检测hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、hsa-miR-let-7e-5p的表达情况，△Ct<0.5。

2.3 Yeasen miRNA茎环倒置定量组合（11139ES&11170ES）

Figure 15. 11139ES-Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

图 15. 11139ES-Hifair™ III 1st Strand cDNA 合成试剂盒（gDNA digester plus）

该试剂盒基于 Hifair™ III 逆转录酶开发。该酶cDNA合成速度快，热稳定性大大提高，同时酶与模板的亲和力增强，适合少量模板、低拷贝基因的逆转录。Hifair™ III逆转录酶合成全长cDNA的能力也得到了提高，可以合成长达19.8kb的cDNA。

Figure 16. 11170ES-Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

图 16. 11170ES-Hieff™ miRNA 通用 qPCR SYBR 预混液

本产品是SYBR Green I嵌合荧光法miRNA定量专用Master Mix。由于miRNA序列较短，且同一家族内的miRNA序列往往高度相似，定量时对特异性要求极高。本产品基于热启动DNA聚合酶，配合优化的Buffer，可大大减少非特异性扩增；同时特制的ROX Reference Dye使得Master Mix适用于所有qPCR仪器，在不同仪器上无需调整ROX，在制备反应体系时只需加入引物和模板即可进行扩增。

2.3.1 兼容全平台qPCR仪器

Figure 17. Compatible results with different qPCR instruments

图 17. 不同 qPCR 仪器的兼容结果

以小鼠肝细胞总RNA为模板，采用Hifair™ III 1st Strand进行逆转录
cDNA合成试剂盒（gDNA digester plus）（Cat#11139ES），将获得的cDNA稀释40倍后采用Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat#11170ES）扩增人mmu-miR-125a基因。

2.3.2 灵敏度高，可达10 pg

Figure 18. Sensitivity detection

图 18. 灵敏度检测

以小鼠肝细胞总RNA为模板，用Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES)进行逆转录，将获得的cDNA进行10倍系列稀释(范围10pg/μL-0.1 μg/μL)，扩增鼠来源的mmu-miR-125a、mmu-miR-132、mmu-miR-351基因。

2.3.3 特异性强，能够区分同一家族中miRNA之间的单碱基差异

图19. 区分 miRNA 之间的单碱基差异

人类hsa-let-7家族有多个miRNA，彼此之间碱基差异较少，甚至仅有一个碱基差异，使用Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES)分别用不同的引物对这些miRNA进行扩增，匹配率计算公式为2^-Δct x 100%。

2.3.4 重复性好

Figure 20. Repeatability detection

图 20. 重复性检测

以人293T细胞Total RNA为模板进行逆转录，用Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES)进行逆转录，将得到的cDNA稀释50倍后采用Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES)在90孔重复实验中扩增人hsa-let-7a基因。

2.3.5稳定性好

Figure 21. Stability analysis of 11170ES at different temperatures for 14 days

图 21.11170ES在不同温度下14天的稳定性分析

Figure 22. Analysis of 11170ES repeated freezing and thawing

图 22. 11170ES 反复冻融分析

Figure 23. Stable analysis properties of the quantitative reaction system at different temperatures for 24h

图23 定量反应体系在不同温度下24h稳定分析特性

以小鼠肝细胞总RNA为模板，用Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES)进行逆转录，将得到的cDNA稀释100倍，扩增小鼠mmu-miR-132基因。

3. 相关产品列表

Yeasen 生物科技（上海）有限公司成立于2014年，是一家从事工具酶原料及抗原抗体研发和生产的高新技术企业，产品涵盖医药、食品安全检测、育种、司法等行业的分子诊断酶、蛋白、抗体等，致力于为生命科学领域的客户提供优质的产品和服务。 Yeasen 如下：

表2. 相关产品列表

方法类型	实验步骤	产品名称	产品代码
尾矿	逆转录	希菲尔™ miRNA 第一链 cDNA 合成试剂盒	11148ES
尾矿	定量PCR	希夫™ miRNA 通用 qPCR SYBR 预混液	11171ES
茎环结构	逆转录	希菲尔™ III 第一链 cDNA 合成试剂盒（gDNA digester plus）（询问）	11139ES
茎环结构	定量PCR	希夫™ miRNA 通用 qPCR SYBR 预混液 (询问）	11170ES