突破性成就 Yeasen 和Molefuture生物技术

随着生物技术的飞速发展，mRNA治疗作为一种新兴的治疗方法，因其可编程性强、反应速度快而备受关注。在mRNA疫苗、基因治疗等领域，高效合成高质量的mRNA是实现治疗目标的关键步骤。而T7 RNA聚合酶在此过程中起着至关重要的作用，它能高效催化mRNA的体外合成。

T7 RNA 聚合酶的 dsRNA 副产物问题

虽然T7 RNA聚合酶在mRNA合成中起着重要作用，但实际操作中经常会产生双链RNA（dsRNA）作为副产物。dsRNA的存在不仅会降低mRNA的产量和纯度，还可能引发非特异性免疫反应，影响疗效和安全性。因此，减少dsRNA的产生已成为业界的迫切需求。 目前减少dsRNA的方法主要有优化反应条件和使用辅助酶，这些方法虽然能在一定程度上减少dsRNA的产量，但往往存在操作复杂、成本增加等问题。

为什么我们要进行T7 RNA聚合酶工程？

直接改造T7 RNA聚合酶以减少dsRNA的产生是更根本的解决方案。酶定向进化技术可以通过精确改变酶的氨基酸序列或结构来改善其催化性能，提高产物的纯度和产量。对于T7 RNA聚合酶而言，针对性改造不仅可以减少dsRNA的产生，还可以提高mRNA合成的整体效率和质量。

作为mRNA体外合成原料供应商， Yeasen 生物技术，以及 其子公司Molefuture 生物技术, 有 利用 ZymeEditor 定向进化平台，开发出一种新型 T7 RNA 聚合酶。为了最大限度地减少体外转录过程中 dsRNA 等副产物的产生，进化团队通过合理设计和定向筛选相结合的方式对 T7 RNA 聚合酶进行了改造。

dsRNA 是如何产生的？

据文献报道，副产物dsRNA的产生主要来源于两个方面（图1）：一是转录早期，T7 RNA聚合酶由起始构象向延伸构象转变时，转录三元复合物易发生解离[1]，导致大量长度在20nt左右的短RNA链（Abortive RNA）释放到体系中。这些RNA链作为“引物”，与长RNA链互补配对，在T7 RNA聚合酶的RNA依赖性RNA聚合酶活性（RDRP活性）作用下延伸生成dsRNA[2,3]。二是T7 RNA聚合酶具有的末端核苷酸转移活性，当转录反应进行到线性模板末端时，T7 RNA聚合酶可以不依赖模板随机地添加数个核苷酸。这些核苷酸序列形成“随机引物”，可反向折叠并与靶mRNA区域互补配对，延伸产生dsRNA。通过成环产生的dsRNA称为回环dsRNA [3,4]。因此，为了减少dsRNA副产物，T7 RNA聚合酶修饰的重点在于稳定早期转录三元复合物或削弱末端转移活性和RNA依赖性RNA聚合酶（RDRP） T7 RNA聚合酶的活性。

图1. 能量屏障及dsRNA形成原理示意图 （未发表数据）

如何克服 能量屏障 T7 RNA 聚合酶 构象转变？

研究团队通过结构和自由能分析，一方面发现T7 RNA聚合酶在构象变化的同时，也存在能量的变化，延伸构象的自由能明显高于起始构象，说明转录过程需要克服更高的能垒才能产生完整的mRNA链，而高能垒不利于构象转变的顺利进行。因此，研究团队利用 合理的 筛选方法鉴定了20多个热点氨基酸，并构建了相应的饱和诱变文库。

如何修改 T7 RNA 聚合酶的末端转移和 RDRP 活性

另一方面，考虑到T7 RNA聚合酶的末端转移和RDRP活性相关功能、位点和结构域的报道有限，且这两个功能相近的活性很可能与T7 RNA聚合酶的主反应——转录活性（即DNA依赖性RNA聚合酶活性，DDRP）共享关键位点，很难找到定点修饰的热点氨基酸。因此，该团队同时构建了多个基于易错PCR的随机突变库，结合ZymeEditor平台的高通量进化能力，每个库的多样性超过10^6。

基于探测的理想发现 T7 RNA聚合酶

为了平衡T7 RNA聚合酶的产生，并监测体外转录反应中dsRNA的含量，该团队参考优化的转录模板，精心设计了多个荧光 探针针对目标mRNA产物的不同区域，这些探针将反应产率、完整性、体系内dsRNA含量等信息与荧光信号关联起来，体系的荧光强度越强，突变体的性能越有利。理论上，该筛选方法可以根据不同探针的荧光强度对突变体进行排序，得到产率高或Abortive RNA减少的T7 RNA聚合酶突变体，以及完整性提高或loopback dsRNA减少的突变体。当反应模板替换为RNA时，也可以对RDR​​P活性降低的突变体进行负向筛选，提高T7 RNA聚合酶的模板选择性。此外，通过在液滴反应体系中加入修饰核苷酸、帽类似物、提高反应温度等，可以进行进一步筛选，选出耐受非天然底物、热稳定性提高的T7 RNA聚合酶突变体。

如何进行最佳筛查 T7 RNA聚合酶？

根据图书馆的规模，团队 开发了基于荧光激活液滴分选（FADS）的超高通量筛选流程和基于传统微孔板方法（MTPS）的高通量筛选流程。通过多轮实验，共计筛选出超过10^7个突变体，得到了多个dsRNA含量明显降低的突变体。其中，部分突变体在反应中表现出Abortive RNA导致的dsRNA含量的降低，表明这些聚合酶突变体的延伸构象更加稳定。部分突变体在反应中表现出回环dsRNA含量的降低，表明这些突变体中末端转移活性或者RDRP活性减弱。

鉴于上述突变体的性能优势源自不同的机制，该团队 构建了针对这些基因的 DNA 改组文库。经过筛选， 最终获得性能优异的突变体 dsRNA 生成量极低，但不影响产量和 mRNA 完整性（图 2）。然而，Moderna 发现的突变体 G47A+884G 的产量受到影响^[5] （未发表）。

图2. 酶的进化过程及突变体性能表征

（未发表）

dsRNA 生成分析 T7 RNA聚合酶 变体？

定量分析后，如图 3 所示，在共转录加帽条件下，使用 9 kb 转录模板，野生型 T7 RNA 聚合酶在使用天然核苷酸时产生约 2.9 ng/μg dsRNA，而商业 T7酶 产生约 0.18 ng/μg dsRNA。然而，每种 T7 RNA 聚合酶变体的 dsRNA 产量 小于 0.10 ng/μg。特别是，一个 变体 仅为0.015 ng/μg，比野生型低近200倍，比商业化低12倍 经过反复测试，在不同反应条件下，各突变体在还原dsRNA方面的性能优势均得到一致体现，表明这些突变体具有良好的体系兼容性，为进一步通过反应缓冲液还原dsRNA的生成奠定了基础 优化。此外，FADS筛选还获得了多个产品完整性和热稳定性提高的变体，可以满足更广泛的体外转录应用的要求

图 3. 使用 T7 RNA 聚合酶变体评估 dsRNA 生成 Yeasen 双链 RNA (dsRNA) ELISA 试剂盒和 J2 抗体点印迹分析。

目前，已有数家合作伙伴试用了T7 RNA聚合酶变体，并获得了他们的高度评价。 新酶的使用简化了mRNA纯化过程，提高了工作效率，并在多种应用场景中表现出色。

这些变体正在申请专利，我们欢迎讨论技术合作和许可。

关于Molefuture Biotechnology

Molefuture Biotechnology 是 Yeasen 生物科技（上海）有限公司，专业提供以酶进化技术为驱动的定制化酶改造解决方案。利用资源 Yeasen 生物科技方面，Molefuture拥有六大技术平台：ZymeEditor创新酶进化平台、多宿主高效表达平台、发酵工艺开发平台、纯化工艺开发平台、超净酶生产平台、酶分析与质控平台。通过这六大技术平台，Molefuture可以提供从酶定向进化、新型酶开发、酶工艺开发到GMP级别放大生产等一整套定制化解决方案，满足体外诊断、生物医药、合成生物学、医学美容、医药中间体等领域的酶应用需求。

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以下是 Yeasen。可提供其他尺寸。我们的产品经过高度优化，可协同工作，帮助确保卓越的性能和可重复性。我们还可以提供定制服务。如果您对未显示的产品感兴趣，请联系我们，我们将与您合作以满足您的需求。

关于阅读：

分享双链RNA（dsRNA）ELISA试剂盒验证报告，促进dsRNA检测的标准化。

参考：

[1] Sousa R, Mukherjee S. T7 RNA聚合酶[J].核酸研究与分子生物学进展,2003:1-41。

[2] Steitz T A. T7 RNA聚合酶从转录起始到延伸的结构变化[J]. 结构生物学新观点，2009, 19(6): 683-690。

[3] Vallejo D, Nikoomanzar A, Paegel BM 等。荧光激活液滴分选用于单细胞定向进化[J]。ACS 合成生物学，2019，8(6): 1430-1440。

[4] Gholamalipour Y、Karunanayake Mudiyanselage A、Martin C T. T7 RNA 聚合酶的 3′ 端添加是 RNA 自模板、分布性和多样性的——RNA-Seq 分析[J]。核酸研究，2018，46(18): 9253-9263。

[5] Dousis A, Ravichandran K, Hobert EM 等。一种可产生不含免疫刺激副产物的 mRNA 的工程化 T7 RNA 聚合酶[J]。《自然生物技术》，2023 年，41(4): 560-568。