共享双链RNA（DSRNA）ELISA试剂盒的验证报告，以促进DSRNA检测的标准化。

您是否正在寻找一种可靠的方法来检测 mRNA 体外转录过程中残留的 dsRNA？双链 RNA (dsRNA) ELISA 试剂盒就是您的最佳选择。然而，由于有几种商业试剂盒可供选择，需要注意的是，验证数据可能并不总是公开的，从而导致 dsRNA 检测不一致。这就是我们分享双链 RNA (dsRNA) ELISA 试剂盒验证报告的原因，该报告涵盖了特异性、精确度、准确性、灵敏度和耐用性。本报告可作为参考指南，用于验证针对特定实验条件和监管药典标准的 dsRNA 残留检测方法。请详细了解我们的验证报告 促进dsRNA检测的标准化。

双链 RNA（dsRNA）ELISA 钾它

背景：

双链RNA（dsRNA）ELISA试剂盒是用于检测mRNA体外转录过程中产生的残留dsRNA的试剂盒，本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）的实验原理和生物素-链霉亲和素扩增体系，可灵敏地检测样本中残留的dsRNA。

汇总数据包含验证参数，涵盖特异性、精密度、准确度、灵敏度和耐久性。该报告可作为参考指南，敦促用户根据其特定实验条件验证 dsRNA 残留检测方法，并遵守监管​​药典标准。

材料和方法：

成套工具： 双链 RNA (dsRNA) ELISA 试剂盒：Cat#36717ES（Yeasen）. 试剂盒包含四种不同类型的 dsRNA 标准样品。用户可以选择符合其生成标准曲线的特定流程的标准样品类型，从而避免制备和测试所有样品的必要性。

方法：实验所需的材料和程序步骤主要由 Yeasen 生物技术。该试剂盒经过大量的测试和评估，确保其性能符合ICH Q2(R1)和2020年版中国药典第四部《9101分析方法验证指导原则》的规定要求。

结果

  1. dsRNA 标准的线性

本报告针对所有四种不同类型的 dsRNA 标准制定了标准曲线，每种标准的长度为 300bp。这些标准包括 STD1，未修饰的 dsRNA；STD2，伪 UTP 修饰的 dsRNA；STD3，N1-Me-伪 UTP 修饰的 dsRNA；以及 STD4，5-OMe-UTP 修饰的 dsRNA。每种类型的 dsRNA 标准均表现出优异的稀释线性，R2 > 0.99，测量浓度的变异系数 (CV) 小于 10%，如表 1 至表 5 所示。

性病名称

UTP 类型

稀释线性 （R2＞0.99）

简历

STD1

超五类

0.0156-1皮克/微升

＜10％

STD2

尿苷三磷酸

0.0156-1皮克/微升

＜10％

STD3

N1-甲基-pUTP

0.0312-1皮克/微升

＜10％

STD4

5-甲基-UTP

0.0625-1皮克/微升

＜10％

表 1. 不同 dsRNA 标准的线性。

STD1 浓度n。 （皮克/微升）

测量平均值 （皮克/微升）

恢复

简历

1

1.0001

100.0％

3.1％

0.5

0.4994

99.9％

2.4%

0.25

0.2516

100.7％

3.3%

0.125

0.1227

98.1％

0.5％

0.0625

0.0640

102.5％

3.2％

0.0312

0.0309

99.2％

1.3％

0.0156

0.0157

100.4％

3.2％

0

/

/

/

表 2.恢复和简历 稀释的 STD1

STD2 浓度n。 （皮克/微升）

测量平均值 （皮克/微升）

恢复

简历

1

1.0001

100.0％

0.7%

0.5

0.4994

99.9％

0.1％

0.25

0.2514

100.6％

0.9％

0.125

0.1232

98.6％

2.5％

0.0625

0.0635

101.6％

1.1％

0.0312

0.0312

99.9％

0.5％

0.0156

0.0155

99.6％

0.0%

0

/

/

/

表 3. 回收率和 CV 稀释的 STD2

STD3 浓度 （皮克/微升）

测量平均值 （皮克/微升）

恢复

简历

2

2.0031

100.2％

1.6%

1

0.9880

98.8％

2.4%

0.5

0.5188

103.8％

1.2％

0.25

0.2383

95.3％

2.2%

0.125

0.1242

99.4％

0.1％

0.0625

0.0629

100.7％

1.8％

0.0312

0.0361

115.7％

1.6％

0

/

/

/

表 4. 回收率和 CV 稀释的 STD3

STD4 浓度 （皮克/微升）

测量平均值 （皮克/微升）

恢复

简历

4

4.0096

100.2％

1.9％

2

1.9940

99.7％

0.7%

1

0.9977

99.8％

0.1％

0.5

0.5108

102.2%

0.1％

0.25

0.2454

98.2％

5.6%

0.125

0.1207

96.5％

2.8％

0.0625

0.0624

99.9％

0.3%

0

/

/

/

表 5. 回收率和 CV 稀释的 STD4

  1. 特异性

  • 使用 dsRNA、ssRNA、dsDNA 和 ssDNA 进行特异性分析。
图 1.该试剂盒仅识别 dsRNA，并不检测 ssRNA、dsDNA 或 ssDNA。

  • 特异性不受 dsRNA 长度的影响。
图2.该试剂盒的特异性对于不同长度（160 bp 和 500 bp）的 dsRNA 保持一致。

  1. 一个准确度

添加 0.5 pg/μL STD1 对已知 dsRNA 含量为 0.36 pg/μL 的 mRNA 样品，以 3 种不同的体积比（1:1、1:20、1:250）进行加标回收率测试，所有加标回收率均在 80-120% 范围内。

加标回收率计算如下：加标 恢复 速率=（测量 专注 后 加标量×总量 体积 的 尖刺 样品−测量 专注 的 这 样本×总数 体积 的 这 样品）/（理论 专注 的 这 峰值×体积 的 这 峰值）×100%

示例

STD1/样品体积比

测量 dsRNA （皮克/微升）

长钉 恢复 速度

样本 (TS)

/

0.36

/

TS+0.5pg/μL STD1

1：1

0.769

81％

TS+0.5pg/μL STD1

1：20

0.777

82％

TS+0.5pg/μL STD1

1：250

0.803

82％

表 6. 加标回收率 分析

  1. 精确

  • 批内精密度

对四份 dsRNA 标准样品分别进行高、中、低三个浓度水平的实验，在一次实验中，每个浓度样品进行了八次重复测试，结果显示变异系数 (CV) 低于 15% 表明具有良好的批内精度。

STD1

理论 浓度 （皮克/微升）

重复

测量平均值 (pg/μL)

简历

1

8

1.0002

3.11％

0.125

8

0.1230

0.46%

0.0156

8

0.0164

3.18％

STD2

理论 浓度 （皮克/微升）

重复

测量平均值 (pg/μL)

简历

1

8

1.0001

0.65%

0.125

8

0.1231

2.46%

0.0156

8

0.0162

0.02%

STD3

理论 浓度 （皮克/微升）

重复

测量平均值 (pg/μL)

简历

2

8

2.0022

1.58％

0.25

8

0.2444

2.17％

0.0312

8

0.0328

1.64％

STD4

理论 浓度 （皮克/微升）

重复

测量平均值 (pg/μL)

简历

8

8

8.0803

0.27%

1

8

0.9650

0.12%

0.125

8

0.1322

2.76％

表 7. 批内精密度分析

  • 批间精密度

使用来自 3 个 批次。在每次实验中，选择高、中、低浓度，对四个 dsRNA 标准样品分别进行三次测试，重复八次。因此，每次实验获取 24 个数据点 浓度水平，然后进行变异系数（CV）分析。结果表明，标准品各浓度的CV均低于15％。

STD1

理论 浓度 （皮克/微升）

独立测试/重复

测量平均值 (pg/μL)

简历

1

3/8

1.0007

2.38％

0.125

3/8

0.1186

3.20%

0.0156

3/8

0.0173

1.27％

STD2

理论 浓度 （皮克/微升）

独立测试/重复

测量平均值 (pg/μL)

简历

1

3/8

0.9987

0.09%

0.125

3/8

0.1269

1.06%

0.0156

3/8

0.0151

0.52%

STD3

理论 浓度 （皮克/微升）

独立测试/重复

测量平均值 (pg/μL)

简历

2

3/8

2.0012

2.37％

0.25

3/8

0.2415

0.14%

0.0312

3/8

0.0330

1.81％

STD4

理论 浓度 （皮克/微升）

独立测试/重复

测量平均值 (pg/μL)

简历

8

3/8

7.9735

1.89％

1

3/8

1.0225

0.13%

0.125

3/8

0.1227

5.63%

表 8. 批间精密度分析

  1. 敏感度

  • 详细程度

检测限 成套工具 是将空白值的平均值加上两倍的标准差而得出的。通过测量24个空白的OD，计算其平均值和标准差，然后将这些值应用到拟合曲线上，可以得到相应的检测限 得到。

外径

双链RNA 标准

空白平均值

标准差 的空白

空白平均值+2SD

详细程度

STD1

0.016

0.00048

0.01696

≤0.001pg/μL

STD2

0.016

0.00072

0.01744

≤0.001pg/μL

STD3

0.034

0.00119

0.03638

≤0.001pg/μL

STD4

0.115

0.00290

0.1208

≤0.01pg/μL

表 9. LOD 分析

  • 最低定量限

数量限制 成套工具 是通过将标准曲线的最低浓度点稀释到更低的水平来建立的，确保最低浓度下的 CV < 20％，从而定义定量阈值。 LOQ如下。

双链RNA 标准

最低定量限

重复

简历（％）

恢复 （%）

STD1

0.0156 皮克/微升

24

＜10%

80~120%

STD2

0.0312 皮克/微升

24

＜10%

80~120%

STD3

0.0156 皮克/微升

24

＜10%

80~120%

STD4

0.125 皮克/微升

24

＜10%

80~120%
表 10.定量限分析

  1. 德耐用性

  • 抗IVT材料干扰

这次测试 旨在评估添加到 信使核糖核酸 用该试剂盒对样本的 dsRNA 进行检测。

将特定浓度的 T7 RNA 聚合酶、RNAse 抑制剂、IPPA（无机焦磷酸酶）、DNase I、VCE（痘苗加帽酶）、2'-O-甲基转移酶 (MT)、1×IVT 缓冲液和 1mM 柠檬酸钠添加到提供的 mRNA 样本中，然后利用 STD3 用于标准曲线制备和样品测试，可以评估该试剂盒检测这些样品中 dsRNA 含量的能力 样品。结果表明，八种不同的酶和缓冲液的存在不会影响 dsRNA 的准确检测。此外，观察到的回收率在 80% 至 120% 的范围内。

IVT 材料

双链RNA 测量值 (pg/μL)

恢复

没有任何

0.6057

100％

T7 RNA聚合酶（15μg/mL）

0.5411

89.32％

小鼠 RNase 抑制剂 (27.5μg/mL)

0.5142

84.88％

无机焦磷酸酶（IPPA 10μg/mL）

0.7132

117.7％

脱氧核糖核酸酶 I (13.75 μg/mL)

0.6077

100.32%

痘苗加帽酶（10μg/mL）

0.6563

108.3％

2´-O-甲基转移酶 (10μg/mL)

0.5776

95.4％

1×IVT缓冲器

0.5003

82.6％

1毫米 柠檬酸钠

0.6251

103.2％

表 11. 添加 IVT 材料的稀释 STD3 的回收率

  • 温度d耐用性

这些工具包分别存放在 4°C 和 37°C 检测7天后dsRNA标准品的浓度变化，结果显示其变化均在20%以内。

双链RNA 标准

双链RNA 测量值（pg/μL）第 0 天

差异 4°C 下 7 天后

STD1

1

10％

STD2

1

5％

STD3

2

7%

STD4

4

11%

双链RNA 标准

双链RNA 测量值 (pg/μL)

差异 37°C 下放置 7 天后

STD1

1

18%

STD2

1

4%

STD3

2

5％

STD4

4

8%

表12. 温度耐久性分析


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      产品名称 库存单位 规格
      双链 RNA（dsRNA）ELISA 试剂盒 36717ES 48吨/96吨
      CleaScrip™ T7 RNA 聚合酶（低 ds RNA，250 U/μL） 10628ES 10/100 库拉索
      T7 RNA聚合酶 GMP级（250 U/μL) 10625ES 10/100 库拉索

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      参考：

      1. ICH，2022：分析方法验证 Q2，草案版本。
      2. 国家药品监督管理局，2007年：《生物制品质量控制分析方法验证评价通则》
      3. 国家药典委员会（ChPC），2020年版：《中国药典》第四部：生物样品定量分析方法验证指导原则

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