通过FADS和半理性设计的较低末端转移酶和RDRP活性的T7 RNA聚合酶（低DSRNA）的开发。

近年来，基于mRNA的药物引起了广泛关注并成为研究热点。 T7 RNAP 因其简单性和高产量催化 RNA 合成的能力而闻名，并且 但在转录过程中，T7 RNAP会产生流产的短RNA、提前终止的RNA、3’末端延伸的RNA等副产物，为dsRNA的形成创造了有利条件，因此减少dsRNA的产生成为实际应用中的迫切需求。

最近，一项开创性的研究题为“FADS 和半合理设计改良的 T7 RNA 聚合酶降低了 dsRNA 的产生，降低了末端转移酶和 RDRP 活性”在线发表于 Yeasen 和Molefuture团队。研究人员通过定向进化和半理性设计相结合的方式，成功改造了T7 RNAP，使其在转录过程中显著减少dsRNA副产物的产生，将其降低至野生型酶的1.8%。

基于 FADS 的 T7 RNAP 筛选

为了筛选 T7 RNAP，我们选择了 FADS（荧光激活液滴分选）来满足蛋白质进化的高通量要求。为了防止细胞过早碎裂，研究人员使用了具有双水相的 PDMS 芯片，其中溶菌酶与芯片上的细胞混合并在液滴中发挥其活性 图 1研究人员生成了几个随机突变库，多样性范围从 10⁵ 到10⁶，经过筛选，鉴定出10个显性变异，分别命名为Mut1至Mut10。  如图所示 图 2E 和 图 2F，Mut1、Mut7、Mut9的dsRNA含量明显低于野生型

图 1. FADS 概览

图 2. 随机文库筛选和变体评估

T7 RNAP的半理性设计

研究人员 进行了半理性设计探索，建立了十个单点饱和文库，并采用传统的基于微量滴定板的双探针方法进行筛选（图 3）添加5'端探针用于检测RNA的产量。

图 3. 结构引导的半理性设计，用于减少 dsRNA

在筛选了1000多个突变体后，研究人员 确定了六个候选基因：Mut11 (K180E)、Mut12 (S228F)、Mut13 (G238L)、Mut14 (A70Q)、Mut15 (A383H) 和 Mut16 (I743L)。所有六个突变体的总 RNA 产量与野生型无显著差异，表明总体转录效率相当。不出所料，Mut11 和 Mut14 的 dsRNA 含量与野生型相比明显较低（图 4）。

图 4. 微量滴定板筛选和变体评估

DNA 改组产生的 Mut17 产生较少的 dsRNA

为了进一步优化T7 RNAP，筛选出4个dsRNA含量较低且能满足生产要求的变体。研究人员随后构建了一个DNA改组文库，并用微量滴定板进行筛选，确定了一个与其亲本T7 RNAP相比dsRNA产量较低的变体，名为Mut17 (A70Q/F162S/K180E)。他们随后分析了Mut17及其亲本变体（Mut14、Mut11和Mut7）的转录产物。如图所示 图 5，与野生型相比，四种变体在转录过程中均表现出 dsRNA 生成量显著减少。值得注意的是，Mut17 的 dsRNA 含量显著降低，仅为 1.80%，在筛选溶剂体系中低至 0.007 ng/μg。

图5. Mut17及其亲本突变的dsRNA含量

突变体的IVT产品的免疫原性明显低于野生型。

下一个， 我们评估了 IVT 产品在小鼠 RA 中的免疫原性W264.7 细胞。如图 2A 和 2B 所示，RA 中的 IFN-β mRNA 和蛋白质水平降低W264与野生型相比，转染了突变体产生的 mRNA 的 .7 细胞表现出更高的免疫反应，表明野生型 T7 RNAP 合成的 mRNA 引发了最强的免疫反应，而来自突变体的 mRNA 则显示出显著降低的反应。 具体而言，经Mut11 RNA处理的细胞中IFN-β mRNA仅为野生型处理细胞的9.7％，其蛋白质为12.93 pg / mL。此外，EGFP的表达在不同的T7 RNAP产生的mRNA之间没有数量或质量的明显差异 （图 6C），满足工业应用的要求。

图 6. 哺乳动物细胞中的 IFN-β 反应和 EGFP 表达

突变体的 RDRP 和末端转移酶活性低得多我们比野生型更高。

为了研究突变对减少 dsRNA 的影响，研究人员 对所有这些突变进行了计算机模拟研究。结果表明，变体中 RDRP 活性明显降低，因为它们显示出利用 RNA 作为模板的趋势下降。同样，这可能对 T7 RNAP 的末端转移酶活性产生了影响。 如图所示 数字 7，不同浓度下，4种变体均表现出与野生型相比低于50％的荧光值。

随后，研究人员利用 3’ 端异质性分析来表征 T7 RNAP 的末端转移活性。当关注 n>0 的 RNA 比例（反映末端转移酶活性）时，研究人员 发现这些RNA在野生型中占82.94%，而突变体中的比例如下：Mut11（70.29%）、Mut7（67.88%）、Mut14（63.31%）和Mut17（55.62%） （数字 8）重要的是，这些百分比与产品中 dsRNA 的丰度高度一致 （图 5）这些结果表明突变体的末端转移酶活性显著降低，这与 RDRP 活性的降低一起导致了 dsRNA 的减少。具体而言，末端转移酶活性可能发挥更关键的作用，这可以通过在 Mut17 中观察到的 n>0 RNA 积累最低来证明，同时 Mut17 也表现出最低的 dsRNA 产量 （图 5 和图 8）。

数字 7. 相对 RDRP 活动

数字 8. RNA 产物 3' 端的异质性

结论

这项研究提供了一种可靠的方法来识别 dsRNA 含量降低的突变体，并成功分离了多个 RNA 依赖性 RNA 聚合酶和末端转移酶活性降低的 dsRNA 突变体。它大大加强了对 mRNA 疗法不可或缺的安全性和有效性的验证，强调了其对推进 mRNA 疫苗和基因治疗应用的深远影响。

与此同时，母公司 Yeasen 还推出了一款T7 RNAP产品，可显著降低dsRNA 内容。多家合作伙伴已经测试了 Molefuture 开发的改良 T7 RNAP 突变体 产品得到了客户的高度认可。客户认为新酶的使用简化了mRNA的纯化过程 并大大降低了IVT的免疫原性 产品，在多个应用场景中展现出优异的表现，证明了其在生物制药领域的广泛潜在应用！

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