HCP检测的概念和必要性
生物制品通常采用重组技术在宿主细胞（如细菌、酵母、哺乳动物、昆虫或植物细胞）中生产，包括单克隆抗体、重组蛋白和疫苗。这些产品的制造和纯化过程不可避免地会引入宿主细胞蛋白 (HCP) 作为杂质，这些杂质包括宿主细胞的结构蛋白和宿主细胞分泌的生长因子，形成具有各种物理化学和免疫学特性的复杂混合物。尽管使用了先进的纯化技术，一些宿主细胞蛋白仍可能作为工艺相关杂质残留在中间药物产品中。
这些杂质具有潜在的免疫原性，可能增强生物制药产品的免疫原性反应，影响其稳定性和疗效，从而对人体安全构成风险。因此，需要制定适当的HCPs去除监控策略，控制最终产品中HCPs的含量，以满足药品质量的要求。
医疗保健人员的监管要求
生物制品中HCP的残留量通常被认为是产品的关键质量属性（CQA）、工艺稳健性监控的重要评价指标和产品的关键质量控制指标。各国监管机构对HCP都有规定，要求对生物药进行分析和纯化，以将宿主细胞蛋白HCP降低到可接受的水平。HCP的可接受水平将根据具体情况进行评估，取决于多种因素，包括剂量、给药频率、药物类型和疾病严重程度。
中国药典（2020版）规定：对于CHO细胞，残留HCP需<0.05%（相当于小于500ppm）；对于大肠杆菌，残留HCP需<0.01%。
美国药典USP<1132>章节规定：应采用高灵敏度的方法来检测药物中的HCP，含量应低于检测限（通常小于100 ppm，即1 mg总蛋白中HCP含量应小于100 ng，或<0.01%）。
欧洲药典EP 2.6.34规定：生物制品中，HCPs的含量应小于0.1%。
人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）指导原则：ICH Q6B规定应采用灵敏且经过验证的方法来监测残留的HCP，残留量通常要求低于100 ppm。
可以看出，监管机构对于HCP的要求高度一致，生物制品工艺开发必须经过HCP检测，证明纯化工艺能够将HCP降低至安全水平，且中美两国均建议最终产品中残留含量限值低于0.01%。
HCP 检测方法
酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最常用的HCP检测方法，2020版中国药典3412/3413/3414章中提到的宿主蛋白残留检测方法均为ELISA方法。
美国药典USP<1132>章节中也提到可采用电泳、ELISA、LC-MS/MS等方法检测HCP含量，其中ELISA由于操作简便、快速、灵敏度高、通量高等特点被推荐作为HCP检测的首选方法。
酶联免疫吸附试验（ELISA）：
目的： 检测HCP中蛋白质的总量，可用于产品开发和过程控制，是目前检测HCP的常用方法。
优点： 灵敏度高、特异性强；高通量、自动化程度高；定量；操作简便、快捷。
缺点： 需要特异性抗体；无法特异性识别和评估个体HCP；方法开发复杂，需要特殊的抗原制备；该方法的影响因素很多，需要评估HCP覆盖率；无法识别物种。
蛋白质印迹法：
目的： 用于对大量样本进行一致性筛查，检测与抗 HCP 抗体反应的未知蛋白质。适用于检测 HCP 并提供有关 HCP 相对分子量的近似信息。
优点： 特异性；结果直观：可视化蛋白质大小和表达水平的差异；可以检测和量化特定的 HCP。
缺点： 半定量；仅限于特定蛋白质：只能检测与抗体结合的HCP；对于复杂的蛋白质混合物不够敏感；蛋白质SDS变性可能导致构象表位的丢失；灵敏度取决于多克隆抗体的质量。
双向凝胶电泳（2-DE）：
目的： 它通常用于上游或下游工艺开发和表征，可以区分单个凝胶上的不同 HCP。
优点： 无需进行Western印迹，避免了转移问题；可以从产品中分离微量HCP杂质；提供有关相对分子量和等电点的近似信息。
缺点： 过多的蛋白质可能会掩盖 HCP 斑点；可以观察到样品中 HCP 的分布，但无法量化。
质谱分析：
目的： 识别单个 HCP，为宿主细胞蛋白质提供准确的识别和定量信息。
优点： 高分辨率和准确性；识别和监测单个 HCP；提供 HCP 的综合光谱；可覆盖多种蛋白质；可识别 HCP 种类。
缺点： 设备和技术要求高；操作复杂；成本高；方法通量低；样品预处理复杂；潜在的基质效应；需要专业的数据分析能力。
ELISA是各国药典推荐的检测生物制品中HCP残留的方法，可以测定HCP的总量，但在识别HCP种类和丰度方面存在局限性，需要与其他方法配合使用。每种检测方法都有其优缺点，实际应用中可根据实验目的、样本特点、准确度、操作便捷性等因素进行选择，结合使用不同的方法，以获得更全面、准确的结果。
此外，美国药典USP<1132>和欧洲药典EP 2.6.34. HOST-CELL PROTEIN ASSAYS指出，在产品研发的不同阶段，应使用不同的ELISA试剂进行HCP检测，将HCP检测方法分为商业化试剂、产品/工艺特定方法、平台方法等。
USP<1132>提及，在缺乏平台方法的情况下，临床前、I期、II期临床试验中可使用商业化试剂；在III期临床试验/工艺验证及产品上市后，由于商业化通用HCP检测试剂的抗体覆盖率不足等限制，应考虑细胞类型、工艺特异性等因素，采用平台方法或针对产品/工艺的方法进行上游工艺开发。
图 1. 在 USP <1132> 中，建议在产品开发的不同阶段使用特定方法检测 HCP。
| 方法 | 商业试剂盒 | 产品/工艺特定检测 成套工具 | 平台检测 成套工具 |
| 可用性 | 随时可用
| 需要制备抗原，包括克隆宿主细胞系
| 需要使用裸细胞或空载体细胞系制备抗原
|
| 发展 | 只需极少的准备 | 检测开发（包括抗原表征、免疫和确认）通常需要至少 6 个月 | 检测开发（包括抗原表征、免疫和确认）通常需要至少 9 个月 |
| 多样性 | 仅限于最常见的表达系统 | 可以使用各种类型的表达系统 | 可以使用各种类型的表达系统 |
| 特异性 | 特异性可能较差，可能存在未被发现的 HCP
| 特异性通常会增强，抗体覆盖范围针对特定的 HCP 模式 | 与商业检测方法相比，特异性有所提高，对检测性能的理解有所增强，HCP 类型的覆盖率也有所提高 |
| 成本 | 初始价格相对便宜，但整个下游净化工艺的开发成本将迅速上升 | 初始成本较高，但盈亏平衡点通常为 100 套试剂盒的价值 | 由于其适用于多种产品，具有显著的成本优势 |
| 依赖 | 依赖于特定的供应商，试剂和控制方案处于“黑箱”状态。 | 全面控制所有试剂和缓冲液，可随时调整 | 对所有试剂拥有完全的所有权和控制权，降低供应链和批次可比性的风险 |
| 监管要求 | 不适合支持营销 授权申请 | 适用于支持授权产品从早期开发到上市的整个过程 | 适用于支持早期开发直至获得上市许可 |
表 1.不同HCP试剂盒类型的比较
Yeasen 生物技术定制HCP检测开发服务
鉴于 HCP 检测的重要性，
定制时间表
宿主细胞残留蛋白检测试剂盒的定制服务通常需要6到10个月。
抗原抗体制备：确定HCP抗原、建立HCP参考标准、设计免疫途径和策略、制备HCP抗体等，一般需要4~6个月。
检测试剂盒开发：抗体优化、覆盖率分析、检测试剂盒方法验证等，一般需要2到4个月。
Yeasen 生物技术 HCP 抗体覆盖率验证服务
众所周知，ELISA是业界检测残留HCP的金标准，但该方法的准确性取决于多克隆抗体对HCP的覆盖率。美国药典和欧洲药典均将免疫纯化和2D-WB列为表征HCP ELISA抗体及其覆盖率的推荐方法。
HCP 抗体覆盖率 确认 服务
2D-WB 首先使用二维凝胶电泳根据大小和电荷分离蛋白质，然后将这些蛋白质转移到膜上，与 HCP 抗体一起孵育以检测蛋白质印迹。
我们 拥有全套2D-WB仪器设备和丰富的实验室经验，为CHO、E.coli、HEK293等宿主细胞的HCP样本提供抗体覆盖率验证服务。
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