在高通量测序中，常规建库需要PCR扩增，一方面是为了扩增微量DNA样本，增加文库产量，另一方面可以放大荧光信号，使测序人员更容易捕捉和识别荧光信号，提高测序准确率。然而PCR就像一把“双刃剑”，在解决了起始样本量少、扩增荧光信号的同时，也引入了扩增误差和偏向性，不能完美呈现基因组序列的“真面目”。另外PCR聚合酶有一定的扩增偏向性，有些区域特别是高GC或低GC、二级结构等区域扩增效率低，难以覆盖，还会引入大量错误的InDel，带来大量Duplication，造成DNA数据量的浪费，增加了测序成本。因此，PCR-Free技术的引入，既具有PCR的优点，又克服了PCR的缺点。它不仅可以带来高灵敏度的高质量文库，实现微量样本的检测，而且准确率高，减少后续变异研究的验证工作量。那么PCR-Free文库到底是什么，它的优势是什么？

1.什么是PCR-Free文库？
2.PCR-Free技术有哪些优势？
3. PCR-Free数据显示
4. 常见问题
5. 产品信息
6.关于阅读

1.什么是PCR-Free文库？

新一代测序技术是现代分子生物学高通量测序研究中最常用的技术，传统的第一代测序已不能完全满足研究者的需求，模式生物的基因组重测序和非模式生物的基因组测序需要更低、更高通量、更快速的测序技术，从而催生了第二代测序技术。第二代测序技术的核心原理是边合成边测序，即通过捕获新合成的末端标记碱基信息来确定DNA序列。第二代测序技术进行DNA测序的主要原理是先将DNA片段化，对片段化的DNA末端进行修复，然后在两侧添加特异性接头然后使用不同的方法生成数百万个空间固定的PCR。对于克隆阵列，利用引物杂交和酶促延伸反应对每次延伸反应掺入的荧光标记进行成像来获得测序数据。

二代测序DNA测序主要包括建库和上机测序两个过程。在建库过程中，通常采用标准PCR扩增随机打断的基因组片段，但对于一些特殊模板，存在二级结构复杂或者热稳定性差等因素影响模板PCR的扩增偏好性，因此并不是所有的基因组序列都能平等地反映在PCR扩增文库中，特别是一些高GC或者高AT含量的模板，有时很难用PCR的方法扩增建库。PCR-free文库与常规PCR文库在上机测序时没有区别，只是建库过程中不进行PCR，理论上PCR-free文库可以改善数据reads的分布，产生更均匀的基因组覆盖。PCR-free文库是对建库方法的一个补充，由于不经过PCR扩增而直接制备成机载文库，可以提高一些高GC或者高AT区域的覆盖度，从而减少PCR引入的错误碱基、数据偏倚、序列重复等。

常规NGS建库的核心步骤是测序前的基因组片段化、末端修复、接头添加、PCR、信号扩增。那么，PCR-Free建库又如何呢？顾名思义就是不需要PCR的建库过程，建库的核心步骤是基因组片段化、末端修复、接头添加、文库质控。但其实这只能算是建库过程中的PCR-Free，真正的PCR-free应该是从建库到测序的过程中不需要进行文库扩增（比如单分子测序技术）或者不需要积累PCR扩增误差的测序技术（比如华大智造的DNBseq）。

图1. 常规建库及PCR-Free建库流程图

2.PCR-Free技术有哪些优势？

在常规建库过程中，扩增酶可能会引入误差，通过循环扩增，这些误差会不断积累并扩增，降低DNA序列复制的保真度。另外，DNA聚合酶也存在一定的扩增偏向性，特别是对于GC含量或二级结构差异较大的区域，导致扩增效率低、覆盖均匀度差；在引入错误的InDels的同时，还会带来大量的重复，造成DNA数据量的浪费，增加测序成本。而PCR-Free技术可以很好的避免常规建库中PCR扩增引入的上述问题。在建库测序过程中，如果存在PCR扩增过程，会对基因组覆盖均匀度产生较大的影响。对于DNA模板来说，有的具有复杂的二级结构，有的热稳定性差异较大，这些因素都会影响PCR扩增的效率。因此，在PCR扩增过程中，不能保证所有的基因组片段都能获得相同的扩增效率，而存在明显的扩增偏向性，如基因组中高GC或低GC区域覆盖度较低等。而PCR-Free测序全程无需PCR，相比PCR建库，提高了基因组高GC区域及AT/TA重复区域的覆盖率，具体优势如下。

2.1 简化建库流程，节省时间

PCR-Free文库制备省去了PCR扩增等步骤，简化了文库制备流程，节省了时间。

2.2 降低建库成本

传统的建库流程中，需要使用价格昂贵的高保真酶进行PCR扩增，以保证序列的真实性，同时PCR-Free省去了PCR扩增步骤，降低了建库成本。

2.3 减少扩增偏差

DNA扩增酶存在一定的扩增偏差，特别是对于GC含量或者二级结构差异较大的模板，因此PCR-Free可以有效避免聚合酶引起的扩增偏差。

2.4 无 PCR 重复

PCR-Free可以减少重复读取并提高唯一映射率和有效数据利用率。

2.5 减少误差

PCR扩增更容易引入Insertion & Deletion的复制错误，导致Indel测序的错误率更高，而PCR-Free可以有效避免此类错误的产生和积累。

3. PCR-Free数据显示

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图2. PCR-Free文库构建的脱机测序数据量

4. 常见问题

问：哪些类型的样本适合建立无PCR文库？

A：对于二级结构复杂、GC含量高、PCR倾向性的样本，可以选择PCR-free文库进行构建。

Q：PCR-free文库的片段大小一般是多少？

A：PCR-free文库本身对片段大小没有特殊要求，PCR产物文库、建库则根据PCR产物的大小来决定，对于基因组文库，建议在350bp左右，这样建库数据的质量相对较好。

5. 产品信息

该产品 Yeasen 可以提供如表1所示。

表 1. 产品信息

6.关于阅读

DNA样本NGS文库制备解决方案

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