描述
T7高产RNA合成试剂盒优化了转录反应体系，该试剂盒利用T7 RNA聚合酶，以含有T7启动子序列的线性双链DNA为模板，以NTPs为底物，控制启动子下游的DNA序列，高效地合成单链RNA，在转录过程中可在底物上添加修饰核苷酸，制备生物素或染料标记的RNA。
本试剂盒可合成长转录本和短转录本，每1 μg DNA模板输入即可产生100-200 μg RNA。转录合成的RNA可用于各种下游应用，例如RNA结构和功能研究，RNase保护，探针杂交，RNAi，显微注射以及体外 翻译。
图 1：体外 RNA转录过程
特征
- 每次反应可从 1 μg 对照模板中生成最多 180 μg RNA
- 针对 IVT 工艺优化的反应系统
- 减少 dsRNA 的产生
- 更高的 RNA 完整性和纯度
应用
- 体外 RNA合成
成分
| 部件编号 | 姓名 | 10623ES50（50吨） | 10623ES60 (100吨) | 10623ES70 (500吨) |
| 10623-A | T7 RNA 聚合酶混合物 | 100 μL | 200 μL | 1 毫升 |
| 10623-B | 10×转录缓冲液 | 100 μL | 200 μL | 1 毫升 |
| 10623-C | ATP（100毫摩尔） | 100 μL | 200 μL | 1 毫升 |
| 10623-D | CTP (100 毫米) | 100 μL | 200 μL | 1 毫升 |
| 10623-E | GTP (100毫摩尔/升) | 100 μL | 200 μL | 1 毫升 |
| 10623-F | 非屏蔽双绞线 (100 毫米) | 100 μL | 200 μL | 1 毫升 |
| 10623-G | 对照 DNA 模板（500ng/μL） | 10 μL | 20 μL | 100 μL |
运输和储存
干冰运输。储存温度为-15℃~-25℃，有效期两年。
数字
图 1. 使用 T7 RNA 合成试剂盒体外合成标准 RNA。
反应产物在PCR仪上37℃反应2h，经磁珠纯化（Cat#12602）后，用NanoDrop分光光度计分析产量结果，如图1所示。
图2. T7试剂盒对不同长度RNA的转录演示，分别在电泳图（图2A）、毛细管电泳图（图2B）和色谱图（图2C）中
图3.体外加帽RNA的合成。
反应产物在PCR仪上37℃反应2h，经磁珠纯化（Cat#12602）后，用NanoDrop分光光度计测定产物产量如图3A所示，用毛细管电泳分析产物完整性如图3B所示。
1. 转录产物产量低
模板的质量与产量息息相关，如果实验组产量明显低于对照组，可能原因有：
①实验模板中含有抑制成分；
② 模板有问题。
建议：
①重新净化模板；
②确定模板定量及其完整性；
③延长反应时间；
④ 增加模板输入量；
⑤尝试其他启动子和RNA聚合酶。
2. 短转录本产量低
转录起始片段过短会抑制反应，当转录产物小于100nt时，延长反应时间为4-8h或增加模板用量至2μg，可提高RNA产量。
3. RNA转录长度大于预期
若电泳结果显示产物条带大于预期的大小，可能原因为：
①质粒模板可能没有完全线性化；
②正义链3’端具有突出的结构；
③RNA具有未完全变性的二级结构。
建议：
①检查模板是否完全线性化，如有必要，进行额外的线性化；
②选择合适的限制性内切酶，避免3’突出，或使用Klenow Fragment/T4 DNA聚合酶完成转录后再进行下一步；
③用变性凝胶检测RNA产物。
4. RNA转录长度小于预期
若电泳结果显示产物条带小于预期的大小，可能原因为：
①模板含有与T7 RNA聚合酶类似的终止序列；
②模板中GC含量高。
建议：
①降低反应温度（例如30℃）。有时降低温度可以增加转录长度，但会降低产量。或者尝试不同的RNA聚合酶进行转录；
②如果模板GC含量较高，则使用42℃ 转录，或添加 SSB 以增加产量和转录长度。
5. 转录产物电泳尾标
电泳过程中有拖尾现象。
可能的原因：
①实验操作过程中受到RNase污染；
②DNA模板被RNase污染。
建议：
①使用RNase free的枪头和EP管，戴一次性乳胶手套和口罩，所有试剂均用RNase free的H2O配制。
②重新纯化模板DNA。
[1] 董Z，郑宁，胡C，等。Nosema bombycis microRNA-like RNA 8 (Nb-milR8) 通过调节宿主家蚕 (Bombyx mori) 中的 BmPEX16 基因表达来增加真菌致病性。Microbiol Spectr。2021；9(2):e0104821。doi:10.1128/Spectrum.01048-21（影响因子：7.171）
[2] 王晓燕，唐珊，叶珊等。利用三链置换扩增级联技术对循环 miR-195-5p 进行超灵敏定量分析。Talanta。2022；242：123300。doi：10.1016/j.talanta.2022.123300（影响因子：6.057）
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