希夫^™ 快速细胞直接 基于SYBR Green染料的RT-qPCR试剂盒适用于各类动物细胞（如细胞系壁细胞及悬浮细胞、原代培养细胞、各类干细胞、iPS细胞等）的RNA提取，无需提取RNA，可直接用于qPCR表达分析，步骤短、操作简便、错误率低，从模板准备到逆转录反应、基因表达分析仅需1.5小时即可完成。

试剂盒内包含逆转录和荧光检测试剂，无需购买额外试剂即可进行基因表达分析。

规格

成分

贮存

将FCD裂解缓冲液和FCD洗涤缓冲液融化并储存在4°C以防止污染。 FCD Stop Solution、DNase I、4× Hifair™ FCD RT Mix、2× Hieff™ FCD qPCR SYBR Master Mix 需保存于-25~-15℃。

指示

1. 裂解产物的制备

1)1.试剂在室温下融化，使用前颠倒并轻轻混匀，轻微离心后使用，避免产生泡沫*。

*未能混合试剂、使用振荡器混合以及未能在冰上配置试剂均会导致反应性能下降。

2)根据细胞类型**，将细胞转移到离心管中，以 5000 rpm 离心 2 分钟，收集细胞并吸出培养基孔。如果细胞在 96 孔板中培养，则可直接吸出培养基。

​​​​​​​​3)每孔加入150 μL FCD Washing Buffer，吹洗细胞，5000 rpm 离心2 min，弃去FCD Washing Buffer***。

4）每孔加入48 μL FCD Lysis Buffer Solution、2 μL DNase Ⅰ Solution，室温下吹打混匀后，静置5分钟，再加入2.孵育完毕后加入5 μL FCD Stop Solution****，再吹打混匀约5次，即得裂解产物*****。

** 细胞数量基本要求为1×10⁴ 每孔细胞数，本试剂盒可用于 1 × 10³ 1×10⁶ 细胞数，若细胞数量较多，可酌情按比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNaseⅠ溶液的用量。

*** 离心条件因细胞而异，因此请以适合所用细胞的速度离心。

**** 将 2.5 μL FCD 终止液添加到 50 μL 裂解物中，并根据需要增加 FCD 终止液的量。

***** 如需长期储存细胞裂解产物溶液，请放置在-20°C 下。

5）室温下融化4 x Hifair™ FCD RT Mix，轻微颠倒混匀，置于冰上，按下表配置反应体系：

*******建议使用量为2-5 μL，尽量不要超过45%。

1. 逆转录

用移液器轻轻吹打并混匀上述配制的反应溶液，按下表步骤进行逆转录反应：

* 建议反转录温度为55℃，对于高GC含量模板或复杂模板，反转录温度可提高至60℃。反转录产物可直接用于下游RT-qPCR检测。为避免反转录体系对qPCR反应的抑制，并获得合适的Ct值（10-35），可将产物稀释10-1000倍后使用。如果短时间内不进行下游实验， 可放置于-20℃保存。

1. 荧光定量PCR

1）反应 系统 配置

建议按以下比例制备反应溶液（冰上制备）。

*不要加入超过RT-qPCR反转录产物体积的1/10，模板浓度过高易导致非特异性扩增，稀释5-50倍为宜。建议模板用量为4 μL，尽量不要超过6 μL。当反应性能不佳时，可在0.2-1.0 μmol/L范围内调整引物浓度。

2）荧光定量PCR扩增步骤（两步法）

3）荧光定量PCR快速扩增流程（两步法）

* 退火/延伸温度及最终延伸时间可根据实验需要进行适当调整，快速程序适用于大部分基因，个别复杂二级结构基因可尝试标准程序。

笔记

1. 本产品仅供研究使用。
2. 为了您的安全，请穿着工作服和戴一次性手套进行操作。

版本EN20230908

文件：

手册

11172-Hieff™ Fast Cell Direct。EN20230908.pdf