描述
产品描述
Hieff NGS™ Ultima 双模式 RNA 文库制备试剂盒是针对 Illumina® 和 MGI® 测序平台的全 RNA 测序文库构建试剂盒，包括 RNA 片段化试剂、逆转录试剂、常规和链特异性 ds-cDNA 合成试剂以及文库扩增试剂。构建测序文库后可使用 mRNA 纯化试剂盒或 rRNA 去除试剂盒。双链合成模块配备两种缓冲液，可满足常规文库或链特异性文库的需要。其中链特异性双链合成 Buffer 中 dTTP 被替换为 dUTP，因此可将 dUTP 添加到 cDNA 的第二链上。本试剂盒采用的高保真 DNA 聚合酶无法扩增含有尿嘧啶的 DNA 模板，实现链特异性。所提供的所有试剂均经过严格的质量控制和功能验证，最大程度地保证了文库构建的稳定性和可重复性。
工作流程
产品组件
| 成分 | 12308ES24 | 12308ES96 | |||
| 12308-A | 2× Frag/Prime 缓冲液 | 250 微升 | 930 微升 | ||
| 12308-B | 第一链酶混合物 | 48 微升 | 192 微升 | ||
| 12308-C | 链特异性试剂 | 150 微升 | 580 微升 | ||
| 12308-D | 第二链缓冲液 (dNTP) | 720 微升 | 2×1440μL | ||
| 12308-E | 第二链缓冲液 (dUTP) | 720 微升 | 2×1440μL | ||
| 12308-F | 第二链酶预混液 | 120 微升 | 480 微升 | ||
| 12308-G | 连接增强剂 | 720 微升 | 2×1440μL | ||
| 12308-H | 新型T4 DNA连接酶 | 120 微升 | 480 微升 | ||
| 12308-I | 2×超级 Canace® II 高保真混音 | 600 μL | 2×1200μL | ||
| 12308-K | 核酸酶游离水 | 300 μL | 1000 μL | ||
注意：该试剂盒与 Illumina 和 MGI 平台兼容，但额外的 Illumina 或 MGI 引物混合物（目录号 13335 Illumina 引物混合物 和 Cat# 13334 MGI 引物混合物 ） 是 必需的。
运输和储存
盒 I 中的 Hieff NGS™ Ultima 双模 mRNA 文库制备试剂盒组件随冰袋一起运输，可以在 2-8°C 下保存一年。
Box II 中的 Hieff NGS™ Ultima 双模 mRNA 文库制备试剂盒组件用干冰运输，可在 -20°C 下保存一年。
注意事项
1 操作
1.1 为了您的安全和健康，操作本产品时请穿戴个人防护装备 (PPE)，例如实验室工作服和一次性手套。本产品仅供研究使用！
1.2 室温下解冻组分。上下颠倒数次以充分混合，短暂旋转并置于冰上备用。
1.3 建议各步反应在带有加热盖的PCR仪上进行，使用前应将PCR仪预热至设定温度。
1.4 必须提供不受RNase污染的物资并定期清洁实验区域。
1.5 操作不当极易造成气溶胶污染，影响结果准确性。建议对PCR反应混合区域和PCR产物纯化检测区域进行强制物理隔离。配备建库专用移液器等设备。
2 接头连接
2.1 Illumina或MGI提供长Adapter（Barcoded Adapter）套件和短Adapter套件，客户可以根据自己的实验需求进行选择。
2.2 建议选用优质、商业化的接头，如选用自制接头，请委托有NGS引物合成经验的公司，并注明需严格控制污染。此外，建议在超净台中配制DNA退火溶液，每次操作仅操作一种接头，防止交叉污染。
2.3 请将适配器放在冰上或4℃解冻；室温操作时，实验室温度不应超过25℃，以防止适配器变性。
2.4 接头的浓度直接影响连接效率和文库产量，试剂盒中加入接头的体积固定为5 μl，建议用0.1×TE缓冲液稀释接头，稀释后的接头可在4°C保存48小时。 表 1 列出了针对不同量 RNA 输入的推荐接头数量。
表 1-1 不同起始 RNA 的 Illumina 接头推荐用量
| 输入总 RNA | 伊路明纳 适配器库存浓度 |
| 10 纳克 | 1 μM |
| 100 纳克 | 1.5 μM |
| 500 纳克 | 3 μM |
| ≥1微克 | 5 μM |
表 1-2 不同 RNA 输入条件下 MGI® 接头推荐用量
| 输入总 RNA | 麦格达 适配器库存浓度 |
| 100-499 鄰 | 2 μM |
| 500-4000 纳克 | 5 μM |
*可根据Total RNA样本类型及投入量调整Adapter的使用。
3 文库扩增
3.1 试剂盒中的高保真DNA聚合酶在第一代DNA聚合酶的基础上，大大提高了其扩增均匀度，无扩增偏向性。
3.2 若目标DNA上连接的是Indexed Adapter（又称长接头或大Y接头），则可使用本试剂盒提供的引物混合物进行扩增；若使用“短接头”或“小Y接头”进行DNA连接，则需使用Indexed Primer进行扩增。
3.3 应严格控制扩增循环数。扩增不足可能导致文库产量低；过度扩增可能引入偏差、错误、重复读取、嵌合产物和扩增突变的积累。表2列出了PCR扩增的推荐循环数。
表 2 建议的 RNA 文库生成循环次数*
| 输入总 RNA | 循环次数 | |
| 非搁浅 | 搁浅 | |
| 10 纳克 | 15 | 15 |
| 100 纳克 | 14 | 14 |
| 500 纳克 | 12 | 十三 |
| 1微克 | 11 | 12 |
注：*文库产量不仅与输入量和扩增循环次数有关 但还受样品质量、破碎条件、分选条件等的影响，在建库过程中要根据实际情况选择最合适的条件。
4 基于珠子的 DNA 清理和尺寸选择
4.1 文库构建过程中有多个步骤需要 DNA 纯化磁珠。我们推荐使用 Hieff NGS™ DNA Selection Beads (
4.2磁珠使用前应先在室温下平衡，否则会降低产量并影响粒径选择效果。
4.3 使用前应将磁珠通过涡旋或移液器吹打混合均匀。
4.4 转移上清液时请勿吸出珠子，即使是微量的珠子也可能影响接下来的反应。
4.5 80%乙醇应新鲜配制，否则影响回收效率。
4.6 磁珠在洗脱产品前应先在室温下干燥。干燥不充分容易造成乙醇残留影响后续反应；干燥过度会导致磁珠破裂，降低纯化产率。通常室温干燥3-5分钟即可使磁珠充分干燥。
4.7 如果需要，用TE缓冲液洗脱后的纯化或大小选择好的DNA样本可以在4°C下保存1-2周，或在-20°C下保存一个月。
5 文库质量分析
5.1 通常可以通过长度分布、浓度检测来评估构建文库的质量。
5.2 文库浓度检测：基于双链DNA荧光染料的方法，例如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR的绝对定量。
5.3 基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等，不适用于文库浓度检测。
5.4 文库浓度检测建议使用qPCR：通过Qubit®、PicoGreen®等基于双链DNA荧光染料的方法，无法有效区分一端连接接头的产物、两端未连接接头的产物以及其他不完整的双链产物。qPCR绝对定量是基于PCR扩增原理，只定量样本两端有接头的完整文库（可测序的文库），排除单端或双端未连接接头的非测序文库的干扰。
5.5 文库长度分布检测可采用Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微流控原理的设备进行。
文件：
12308ES-Hieff NGS™ Ultima 双模式 RNA 文库制备试剂盒-Ver.EN20230327.pdf
引文及参考文献：
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