希夫NGS^商标 EvoMax RNA 文库制备试剂盒 (dUTP) 是一种 预混合， 放线菌素D 免费和 链特异性 全部的 RNA测序文库 准备 试剂盒兼容Illumina和MGI平台。本产品有两种类型： 管子 或密封套件，以及 这个套件更多 方便的 是否通过自动液体处理装置 或手动操作 .试剂盒含有RNA片段化试剂、逆转录试剂、链特异性ds-cDNA合成试剂、文库扩增试剂。 可与mRNA纯化试剂盒或rRNA去除试剂盒联用， 进行mRNA或lncRNA研究。本产品优化了反转录模块，获得不含放线菌素D的高链特异性文库，更大程度上保证了实验者的安全。所有试剂均经过严格的质量控制和功能验证，最大程度保证文库的稳定性和重复性 准备。

规格

成分

注：* 表示该组分不包含在试剂盒中。如果使用完整的接头，则需要引物混合物，否则不需要。‘t. 该试剂盒与 Illumina 和 MGI 平台兼容，但需要额外的引物混合物（Cat # 13334 Primer Mix for MGI^商标 如果使用完整的适配器，则需要 Cat # 13335 Primer Mix for Illumina® 或 MGI 平台。

数字

板试剂组布局。

图1：封板文库试剂盒试剂布局

图 2. 简化组件 EvoMax RNA 文库制备试剂盒。

贮存

本品应储存于-25~-15℃ 1 年。

指示

1. 20 μL 系统建议添加量为 0.1-1 单位（U）， 并可根据实际结果调整投入量。

2. 根据实验的需要，dUTP的终浓度可以在0.2~0.6 mM之间调整，也可选择性地添加0.2 mM的dTTP。

3. 25~37℃反应时间 可根据实验需要在5~10分钟内调整。

笔记

1. 手术

1） 请穿着工作服和一次性手套进行操作，为了您的安全。

2） 室温下解冻组分。上下颠倒几次以充分混合，短暂旋转并置于冰上备用。

3） 建议各步反应在带有加热盖的PCR仪上进行，使用前应将PCR仪预热至设定温度。

4） 必须使用不含 RNase 污染的耗材并定期清洁实验区域。ThermoFisher 的 RNAZap^商标 建议使用高效核酸去除喷雾去除RNase污染。

5） 操作不当很可能造成气溶胶污染，影响结果的准确性。建议对PCR反应混合区域和PCR产物纯化检测区域进行强制物理隔离。 配有建库专用移液器等设备。

6)本试剂为一次性使用，严禁多次使用。

7)本产品仅供研究使用。

2. 适配器连接

1） Illumina或MGI长适配器（Barcoded Adapter）套件和短适配器套件可供客户根据实验需求进行选择。

2） 建议选用优质、商业化的接头，如选用自制接头，请委托有NGS引物合成经验的公司，并注明需严格控制污染。此外，建议在超净台中配制DNA退火溶液，每次仅操作一种接头，防止交叉污染。

3） 请在冰上或 4°C 下解冻适配器；室温操作时，实验室温度不应超过 25°C，以防止适配器变性。

4） 接头的浓度直接影响连接效率和文库产量。 试剂盒中添加的接头体积固定为5μl，建议用0.1×TE缓冲液稀释接头，稀释后的接头可在4℃保存48小时。 1 列出了针对不同量 RNA 输入的推荐接头数量。

表 1-1 不同起始 RNA 的 Illumina 接头推荐用量

表 1-2 不同起始RNA对应的MGI接头推荐用量

* 可根据不同种类的总RNA样本和输入量调整接头使用量

3.文库扩增

1）试剂盒中的高保真DNA聚合酶在第一代DNA聚合酶的基础上，大大提高了其扩增均匀度，无扩增偏向性。

2） 应严格控制扩增循环数。扩增不足可能导致文库产量低；过度扩增可能引入偏差、错误、重复读取、嵌合产物和扩增突变的积累。 表 2 列出了 PCR 扩增的推荐循环数。

3）表2推荐的推荐循环数可以满足绝大多数建库需求，如果您的样本质量较差（如降解严重的FFPE样本），可以根据实际情况适当增加循环数。注意不同物种和组织的mRNA存在差异，扩增循环数需适当调整。

表 2 输入总 RNA 量和推荐扩增循环数表 *

[注]：*文库产量不仅与投入量、扩增循环数有关，还受样品质量、打断条件、分选条件等影响，在建库过程中应根据实际情况选择最合适的条件。

4. 基于珠子的 DNA 清理和尺寸选择

1) 文库构建过程中有多个步骤需要 DNA 纯化磁珠。我们推荐使用 Hieff NGS™ DNA Selection Beads（Yeasen 使用 AMPure® XP 磁珠 (Beckman Cat#A63880) 进行 DNA 纯化和尺寸选择。

2）磁珠使用前应平衡至室温，否则 产量会下降，且会影响筛选效果。

3） 使用前应通过涡旋或移液将磁珠混合均匀。

4） 转移上清液时不要吸出珠子，即使是微量的珠子也可能影响接下来的反应。

5） 80%乙醇应新鲜配制，否则影响回收效率。

6） 磁珠在洗脱产品前需室温干燥，干燥不充分易造成乙醇残留影响后续反应；干燥过度则易造成磁珠破裂，降低纯化产率。一般室温干燥3-5分钟即可使磁珠充分干燥。

7） 如果需要，在 TE 缓冲液中洗脱的纯化或大小选择的 DNA 样本可以在 4°C 下保存 1-2 周，或在 -20°C 下保存一个月。

5.图书馆质量分析

通常可以通过浓度检测、长度分布检测来评估构建文库的质量。

6. 其他材料

1）mRNA富集试剂盒：Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit V2（Yeasen 猫号#12629）。

2）rRNA去除试剂盒：Hieff NGS® MaxUp 人类 rRNA 去除试剂盒（rRNA 和 ITS / ETS）（Yeasen Cat # 12257) 或其他 rRNA 去除试剂盒。

3）磁珠RNA纯化：Hieff NGS® RNA Cleaner（Yeasen Cat # 12602) 或其他同等产品。

4) DNA 纯化磁珠：Hieff NGS® DNA Selection Beads（Yeasen Cat # 12601) 或 AMPure® XP Beads (A63880) 或其他同等产品。

5)RNA质控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他同等产品。

6) 适配器：供Illumina® 使用的完整适配器（Cat # 13519-13520 或其他等效产品）或供MGI® 使用的完整适配器（Cat # 13360-13362 或其他等效产品）。

7. 文库质量检查

Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip或其他同等产品；文库定量试剂。

8. 其他材料

无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

流程图

图1：RNA文库构建流程

不同质量 FFPE 样本的 RNA 文库制备

对于严重降解的 FFPE RNA（DV 200 <50%）和低输入样本，我们建议在接头连接后采用双重纯化方案，以减少文库损失。

不同质量 FFPE 样本的峰图