希夫NGS^商标 DNA Library Prep Kit 是专为 伊路明纳® 麦吉尔® 测序平台本产品在上一代建库试剂盒的基础上，在末端修复、dA加尾、接头连接等方面表现出比前代更高的效率，高保真酶显著提高扩增的均一性和保真度。试剂盒兼容大部分DNA样本类型，包括动物/植物/微生物标准基因组DNA、FFPE样本、cfDNA、ChIP DNA等。

规格

成分

贮存

本品应储存于-25~-15℃ 1 年。

笔记

1. 关于手术

1.为了您的安全，请穿着工作服和戴一次性手套进行操作。

2. 在室温下解冻组件。 解冻后，通过涡旋充分混合，短暂旋转管子并将它们放在冰上以备后用。

3. 在配制各步反应液时，建议用移液器充分混匀或轻轻摇晃，剧烈摇晃可能会造成文库产量的下降。

4. 强烈建议使用带滤芯的移液器吸头，以避免交叉污染。处理不同样品时，务必更换移液器吸头。

5. 操作不当极易造成气溶胶污染，影响结果准确性。建议对PCR反应混合区域和PCR产物纯化检测区域进行强制物理隔离。配备建库专用移液器等设备。对每个区域进行常规清洁，用 0.5% 次氯酸钠或 10% 漂白剂擦拭表面

6.本产品仅供研究使用。

2. DNA碎片

1. 该试剂盒适用于机械碎裂的 DNA 或酶碎裂的 DNA。

2. 本试剂盒可兼容100 pg - 1000 ng的输入DNA。强烈建议使用A260/A280 = 1.8-2.0的高质量输入DNA。表1列出了建议的输入DNA量。

表 1 建议的 DNA 输入量

笔记：当输入DNA质量较差或需要进行DNA大小选择时，应相应增加输入DNA量。

3.“输入 DNA”具体指准备进行末端修复/dA 加尾的 DNA 样本。

4. 如果输入的 DNA 样本含有高浓度的盐类（如金属螯合剂），建议在片段化后进行磁珠纯化/大小选择步骤。盐可能会影响以下反应的效率，包括末端修复和 dA 加尾。如果使用机械片段化方法，请在 TE 缓冲液中洗脱 DNA 样本，而不是使用灭菌超纯水进行片段化。如果在进行文库制备之前未进行磁珠清理或大小选择，则请确保使用的终止缓冲液不含过量的金属螯合剂。否则，请清理或大小选择片段化的样本，并在进行文库制备之前将其洗脱在 TE 缓冲液或灭菌超纯水（≤50 μL）中。

3. 接头连接

1。 Illumina或MGI长适配器（Barcoded Adapter）套件和短适配器套件可供客户根据实验需求进行选择。

2。 建议选择高品质、市售的接头，如选择自制接头，请委托有NGS引物合成经验的公司，并注明需要严格控制污染。此外，建议在超净台中配制DNA退火溶液，每次只操作一种接头，防止交叉污染。

3。 请在冰上或 4°C 下解冻适配器；室温操作时，实验室温度不应超过 25°C，以防止适配器变性。

4。 接头的质量和浓度会直接影响连接效率和文库产量。接头浓度过高容易形成接头二聚体，过低则会降低连接效率和文库产量。使用接头时，根据Input DNA量用TE Buffer进行相应稀释。表2 -5 列出了使用该试剂盒针对不同输入 DNA 量的推荐适配器稀释方法。

桌子 2 推荐的 Illumina^商标 不同输入的适配器数量 脱氧核糖核酸

桌子 3 推荐的 MGI^商标 不同输入的适配器数量 脱氧核糖核酸

桌子 4 推荐的 Illumina^商标 乌米 不同输入的适配器数量 脱氧核糖核酸

桌子 5 推荐的 MGI^商标 乌米 适配器米不同输入的计数 脱氧核糖核酸

4. 基于珠子的 DNA 清理和尺寸选择

1. DNA 大小选择可以在末端修复/dA 加尾之前、接头连接之后或扩增之后进行。

2. 如果输入的 DNA 量超过 50 ng，建议在接头连接后立即进行大小选择； 否则，请在扩增后进行尺寸选择。

3. 连接增强剂含有高浓度的 PEG，可能会对准确的片段选择造成很大影响。因此，如果要在接头连接后立即进行片段选择，强烈建议在片段选择之前添加珠子清理步骤。如果片段选择步骤在末端修复/dA 加尾之前或之后进行，则可以直接进行片段选择步骤 图书馆扩增。

4. 磁珠使用前应先在室温下平衡，否则产量会下降，并且影响大小选择效果。

5. 使用前应通过涡旋或移液将磁珠混合均匀。

6. 转移上清液时不要吸出珠子，即使是微量的珠子也可能影响接下来的反应。

7. 80%乙醇应新鲜配制，否则影响回收效率。

8. 为了准确选择尺寸，建议从大于 100 μL 的体积开始。如果小于 100 μL，建议用超纯水将体积补足至 100 μL。

9. 磁珠在洗脱产品前需室温干燥，干燥不充分易造成乙醇残留影响后续反应；干燥过度则易造成磁珠破裂，降低纯化产率。一般室温干燥3-5分钟即可使磁珠充分干燥。

10. 如果需要，纯化或大小选择的 DNA 样本洗脱于 0.1× TE 缓冲液可在 4°C 下保存 1-2 周，或在 -20°C 下保存一个月。

5. 文库扩增

1. 是否进行文库扩增取决于DNA输入量、接头类型、测序数据应用等。使用部分接头时，需要进行扩增步骤。使用全长接头时，如果输入DNA<200 ng，建议进行扩增；否则，无需进行扩增。

2. 应严格控制扩增循环数。扩增不足可能导致文库产量低；过度扩增可能导致偏差增加、错误、重复读取和嵌合产物。表 6 列出了针对 1 μg 文库产量的建议循环数。

桌子 6 建议的生成循环次数 1,000 ng 文库产量

笔记：

1.桌子 6 显示了使用200 bp左右的高质量Input DNA测试的loop参数数目。FFPE DNA质量差异很大，当DNA质量差或文库长度较长时，需要适当增加循环次数，才能获得足够的文库。

2.我如果在建库过程中需要进行大小选择，建议使用较高的文库扩增循环数；否则，建议使用较低的循环数。

3.我如果使用不完整的接头，则至少需要扩增2个循环才能形成完整的接头。

6. 图书馆质量分析

1. 构建的文库质量一般通过测量浓度和粒径分布来分析。

2. 图书馆‘可以通过基于荧光的方法（例如 Qubit 和 PicoGreen 或 qPCR）测量浓度。

3.不建议使用基于吸光度的定量方法，例如 NanoDrop。

4. 建议使用qPCR方法进行文库定量：Qubit、PicoGreen等荧光方法无法区分不完整的dsDNA结构（无接头或仅一端连接接头的插入片段）和完整的文库，而qPCR方法只会对两端连接接头的完整文库（可测序文库）进行扩增和测定，从而为上样提供更准确的测量。

5. 可以使用Agilent Bioanalyzer或其他基于毛细管电泳或微流体原理的设备来分析文库的大小分布。

7. 其他材料

1。 DNA纯化磁珠：Hieff NGS^商标 DNA 选择珠（Yeasen 目录号 12601) 或 AMPure^® XP Beads（A63880）或其他同等产品。

2. 适配器：Illumina 完整适配器： Yeasen 猫号#13519-13520; 384 双 CDI 引物： Yeasen 猫号#12412~猫号#12413； 384 个独特双重索引 (UDI) 引物： Yeasen 猫＃12312〜猫＃12315； UMI UDI 适配器： Yeasen 猫号#13370~猫号#13371; MGI 完整适配器： Yeasen 猫号#13360-13362。 DNA引物混合物：猫＃12190 或者 猫＃12191。

3. 文库质量分析：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip或其他同等产品；文库定量试剂。

4. 其他材料：无水乙醇，无菌超纯水，低保留移液器吸头，PCR管，磁力架，热循环仪等。

指示

步骤1. 末端修复/dA-Taling

1. 解冻 表中提到的试剂 7 . 倒置以彻底混合试剂并将其放置在冰上以备后用。

2. 根据表格组装试剂 7 在冰上。

桌子 7 末端修复/dA-Tailing反应体系

3. 通过移液或摇动轻轻混合，短暂离心以使溶液沉淀。

4. 将管放入热循环仪中并根据表 8 设置程序。

桌子 8 末端修复/dA 尾添加 反应程序

第 2 步。 接头连接

1. 根据表2将适配器稀释至适当浓度-5。

2. 解冻 表中提到的试剂 9 . 倒置以彻底混合试剂并将其放置在冰上以备后用。

3. 根据表格组装试剂 9 在冰上。

桌子 9 接头连接 关于动作系统

笔记: *连接增强剂很粘稠。请通过倒置或搅拌彻底混合，然后 使用前短暂离心。

**原始浓度 伊路明纳^商标 YEASE的接头为15 μM，请根据输入量稀释接头 和 使适配器的体积固定为 5 μL。

**原始浓度 麦格达^商标 YEASE 适配器为 10 μM。请根据输入量稀释接头 和 使适配器的体积固定为 5 μL。

4. 轻轻上下吹打以充分混合，然后短暂旋转以收集管壁上的所有液体。

5. 按照表所示，将样品放入预热的热循环仪中孵育 10 并执行适配器连接反应。

桌子 10 接头连接反应程序

步骤3. 接头连接后的清理或尺寸选择

此步骤用于纯化或筛选步骤中的产品 2 使用磁珠纯化。纯化过程可以去除残留的接头、接头二聚体或其他不可用的产物。

克莱尔n 接头连接的 DNA

1. 准备工作：进行 Hieff NGS^商标 将 DNA Selection Beads 从冰箱中取出，在室温下平衡至少 30 分钟。新鲜制备 80% 乙醇。

2. 通过倒置或涡旋彻底混合珠子。

3. 添加 88 微升 希夫NGS^商标 DNA 选择珠 (0.8×，珠子：DNA = 0。8：1)加入到含有接头连接产物的管中，摇匀，室温孵育5分钟。

4. 短暂离心使溶液沉下，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后（约5 min），小心吸去液体。

5. 将管子放在磁力架上， 直接向管中加入200 μL新鲜配制的80%乙醇，室温孵育30秒，小心吸去液体。

6. 重复 重复步骤5。

7. 将管子放在磁力架上，打开盖子，干燥珠子直到珠子刚刚破裂（不超过 5 分钟）。

8. 将管从磁力架上取下进行洗脱 并洗脱 DNA

1). 如果产品不需要选择尺寸，则添加21 μL ddH₂O 直接加入。涡旋或上下吹打 10 次以充分混合。室温孵育 5 分钟。短暂旋转管子并将其放在磁力架上。当溶液澄清时（约 5 分钟），小心地将 20 μL 上清液转移到新的 PCR 管中，不要接触磁珠。

2). 如果产品需要选择尺寸，请添加102 μL ddH₂O 直接加入。涡旋或上下吹打 10 次以充分混合。室温孵育 5 分钟。短暂旋转管子并将其放在磁力架上。当溶液澄清（约 5 分钟）时，小心地将 100 μL 上清液转移到新的 PCR 管中，不要接触磁珠。

笔记：若纯化产物需要保存，可以用TE Buffer进行洗脱。

接头连接 DNA 的大小选择

1.准备工作：进行 Hieff NGS^商标 将 DNA Selection Beads 从冰箱中取出，在室温下平衡至少 30 分钟。新鲜制备 80% 乙醇。

2. 通过倒置或涡旋彻底混合珠子。

3. 根据目标大小，按照表 1 中的步骤将第一轮磁珠加入 100 μL 纯化的 DNA 模板中 11. 通过涡旋或移液 10 次彻底混合。

桌子 11 推荐的珠子：基于珠子尺寸选择的 DNA 比例

笔记：表中“×”表示DNA样本体积。例如，文库插入片段长度为250 bp，样本DNA体积为100 μL，第一轮分选所用磁珠体积为0.7×100 μL=70 μL；第二轮分选所用磁珠体积为0.20×100 μL=20 μL。表中推荐的磁珠体积为接头连接后的DNA。如果在连接前进行大小选择，请参考Hieff NGS制造商的方案^商标 DNA 选择珠（Cat#12601）。

4. 我室温下孵育 5 分钟。

5. 短暂旋转管子并将其放在磁力架上。当溶液澄清（约 5 分钟）时，将上清液转移到新的 PCR 管中。

6. 将第二轮选择珠添加到步骤 5 中的样本中 根据表 11。通过涡旋或上下移液至少 10 次来彻底混合。

7. 我室温下孵育 5 分钟。

8. 短暂离心使溶液沉下，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后（约5 min），小心吸去液体。

9. 将管子放在磁力架上， 直接向管中加入200 μL新鲜配制的80%乙醇，室温孵育30秒，小心吸去液体。

10. 重复 步 9 再次。

11. 将管子放在磁力架上，打开盖子，干燥珠子直到珠子刚刚破裂（不超过 5 分钟）。

12. 将管从磁力架上取下进行洗脱， 和 直接加入21 μL ddH₂O. 充分混匀，旋涡震荡或上下吹打，室温孵育 5 分钟。（注：如需保存纯化产物，请用 TE Buffer 洗脱。）短暂离心，置于磁力架上直至液体变清澈（约 5 分钟）。小心地将 20 μL 上清液转移至新的 PCR 管中，不要接触磁珠。

步骤4 文库扩增

此步骤可以通过 PCR 扩增富集纯化的或大小选择好的产物。

1。 解冻表中列出的试剂 12，颠倒混匀，置于冰上备用。

2。 在已灭菌的 PCR 管中组装以下反应。

桌子 12 接头连接 DNA PCR 反应 系统

[笔记]： * 如果使用了完整的适配器， 希夫NGS^商标 底漆混合物 （Yeasen 猫＃12190 或 Cat#12191） 需要;如果使用不完整的适配器（Cat#12412~Cat#12413、Cat#12312〜猫＃12315，Cat#13370~Cat#13371），请参考试剂盒说明书，使用试剂盒提供的Index Primer进行扩增。

3. 通过移液或摇动轻轻混合，并短暂离心以使溶液沉淀。

4. 将管放入热循环仪并根据表格设置程序 十三 开始放大。

桌子 十三 PCR扩增反应程序

步骤5 扩增后清理/片段选择

清洁 向上步骤参考 步 3. 希夫NGS^商标 DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）用于纯化PCR产物。如需进行大小选择，请参考 步 3。

第 6 步 最终文库的质量控制

构建文库的质量一般通过测定浓度和粒径分布来评估，具体可参考注释 6。