Hieff NGS™ OnePot Pro DNA 文库制备试剂盒 V4 是专为与 Illumina 配合使用而设计的新一代酶文库制备试剂盒 以及华大智造高通量测序平台。与传统建库方法相比，该试剂盒采用高品质的片段化酶，省去了繁琐的超声处理过程。片段化和末端修复模块合并为一个步骤，大大减少了建库时间和成本。该试剂盒适用于多种样本类型，包括动植物基因组、微生物基因组等，样本输入范围为 1 ng 至 1 μg。酶促片段化可确保不同物种的片段大小均匀，物种间差异最小。此外，该试剂盒可与 Illumina 配对使用 或 MGI 用于在 Illumina 或 MGI 高通量平台上测序的适配器和引物。

规格

成分

贮存

本产品应在-25~-15℃下保存1 年。

笔记

1. 关于操作

1. 请穿戴工作服和一次性手套进行操作，为了您的安全。

2. 在室温下解冻组件。 解冻后，通过涡旋充分混合，短暂旋转管子并将它们放在冰上以备后用。

3. 在配制各步反应液时，建议用移液器充分混匀或轻轻摇晃，剧烈摇晃可能会造成文库产量的下降。

4. 强烈建议使用带滤芯的移液器吸头，以避免交叉污染。处理不同样品时，务必更换移液器吸头。

5. 操作不当极易造成气溶胶污染，影响结果准确性。建议对PCR反应混合区域和PCR产物纯化检测区域进行强制物理隔离。配备建库专用移液器等设备。对每个区域进行常规清洁，用 0.5% 次氯酸钠或 10% 漂白剂擦拭表面

6.本产品仅供研究使用。

1. 该试剂盒兼容 100 pg - 1000 ng 输入 DNA。强烈建议使用 A260/A280 = 1.8-2.0 的高质量输入 DNA。

2. 如果输入 DNA 中引入了高浓度的盐（如金属螯合剂），则后续实验可能会受到影响。我们建议在 氢键₂哦 造成碎片化。

3. 请参考表格 6 标准DNA样本的碎片时间。该试剂盒具有较低的碎片偏差，并为具有广泛 GC 组成的 DNA 样本提供均匀的 GC 覆盖率。 请根据您的实验要求调整碎裂时间。

4. 为了准确碎裂，请在冰上准备反应。

3. 适配器连接

1. Illumina或MGI长适配器（Barcoded Adapter）套件和短适配器套件可供客户根据实验需求进行选择。

2. 建议选用优质、商业化的接头，如选用自制接头，请委托有NGS引物合成经验的公司，并注明需严格控制污染。此外，建议在超净台中配制DNA退火溶液，每次仅操作一种接头，防止交叉污染。

3. 请在冰上或 4°C 下解冻适配器；室温操作时，实验室温度不应超过 25°C，以防止适配器变性。

4. 接头的质量和浓度会直接影响连接效率和文库产量。接头浓度过高容易形成接头二聚体，过低则会降低连接效率和文库产量。使用接头时，根据Input DNA量用TE Buffer进行相应稀释。表2 -3 列出了使用该试剂盒针对不同输入 DNA 量的推荐适配器稀释方法。

表 1 针对不同输入 DNA 的推荐 Illumina 接头用量

表 2 针对不同输入DNA的推荐MGI接头用量

4. 基于珠子的 DNA 清理和尺寸选择

1. DNA 片段大小选择步骤可以在接头连接之后或文库扩增之后进行。

2. 如果输入的 DNA 量超过 50 ng，建议在接头连接后立即进行大小选择； 否则，请在扩增后进行尺寸选择。

3. 连接增强剂含有高浓度的 PEG，可能会对准确的片段选择造成很大影响。因此，如果要在接头连接后立即进行片段选择，强烈建议在片段选择之前添加珠子清理步骤。如果片段选择步骤在末端修复/dA 加尾之前或之后进行，则可以直接进行片段选择步骤 图书馆扩增。

4. 磁珠使用前应先在室温下平衡，否则产量会下降，并且影响大小选择效果。

5. 使用前应通过涡旋或移液将磁珠混合均匀。

6. 转移上清液时不要吸出珠子，即使是微量的珠子也可能影响接下来的反应。

7. 80%乙醇应新鲜配制，否则影响回收效率。

8. 为了准确选择尺寸，建议从大于 100 μL 的体积开始。如果小于 100 μL，建议用超纯水将体积补足至 100 μL。

9. 磁珠在洗脱产品前需室温干燥，干燥不充分易造成乙醇残留影响后续反应；干燥过度则易造成磁珠破裂，降低纯化产率。一般室温干燥3-5分钟即可使磁珠充分干燥。

10. 如果需要，纯化或大小选择的 DNA 样本洗脱于 0.1× TE 缓冲液可在 4°C 下保存 1-2 周，或在 -20°C 下保存一个月。

5. 文库扩增

1. 是否进行文库扩增取决于DNA输入量、接头类型、测序数据应用等。使用部分接头时，需要进行扩增步骤。使用全长接头时，如果输入DNA<200 ng，建议进行扩增；否则，无需进行扩增。

2. 应严格控制扩增循环数。扩增不足可能导致文库产量低；过度扩增可能引入偏差、错误、重复读取和嵌合产物增加。表 3 列出了针对 1 μg 文库产量的建议循环数。

表 3 建议的生成循环次数 1,000 ng 文库产量

笔记：

1.表格 3 显示了使用200 bp左右的高质量Input DNA测试的loop参数数目。FFPE DNA质量差异很大，当DNA质量差或文库长度较长时，需要适当增加循环次数，才能获得足够的文库。

2.我如果在建库过程中需要进行大小选择，建议使用较高的文库扩增循环数；否则，建议使用较低的循环数。

3.我如果使用不完整的接头，则至少需要扩增2个循环才能形成完整的接头。

6. 图书馆质量分析

1. 构建的文库质量一般通过测量浓度和粒径分布来分析。

2. 可以通过基于荧光的方法（例如 Qubit 和 PicoGreen 或 qPCR）测量文库浓度。

3. 不建议使用基于吸光度的定量方法，例如 NanoDrop。

4. 建议使用qPCR方法进行文库定量：Qubit、PicoGreen等荧光方法无法区分不完整的dsDNA结构（无接头或仅一端连接接头的插入片段）和完整的文库，而qPCR方法只会对两端连接接头的完整文库（可测序文库）进行扩增和测定，从而为上样提供更准确的测量。

5. 可以使用Agilent Bioanalyzer或其他基于毛细管电泳或微流体原理的设备来分析文库的大小分布。

7. 其他材料

1. DNA纯化磁珠：Hieff NGS^商标 DNA 选择珠（Yeasen 目录号 12601) 或 AMPure^® XP Beads（A63880）或其他同等产品。

2. 适配器：Illumina 完整适配器： Yeasen 猫号#13519-13520; 384 双 CDI 引物： Yeasen 猫号#12412~猫号#12413； 384 个独特双重索引 (UDI) 引物： Yeasen 猫＃12327~猫＃13330； UMI UDI 适配器： Yeasen 猫号#13370~猫号#13371; MGI 完整适配器： Yeasen 目录号：13360-13362. DNA 引物混合物：猫＃12190 或者 猫＃12191.

3. 文库质量分析：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip或其他同等产品；文库定量试剂。

4. 其他材料：无水乙醇，无菌超纯水，低保留移液器吸头，PCR管，磁力架，热循环仪等。

8. 工作流

图 1.工作流程 一锅 专业版 脱氧核糖核酸 文库制备试剂盒