描述
细胞计数试剂盒-8（CCK-8）是基于WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺基苯基）-2H-四唑单钠盐）试剂的快速高灵敏检测试剂盒。WST-8是MTT的升级试剂，可被线粒体中的脱氢酶还原为高度水溶性的橙黄色甲臜。生成的甲臜量 与活细胞数成正比，用酶标仪检测450nm处甲臜的OD值可间接指示活细胞数。本试剂盒广泛应用于药物筛选、细胞增殖及细胞毒性试验、肿瘤药敏试验、生物因子活性检测等。
CCK-8方法的优点
1. CCK-8方法与其他细胞增殖/毒性检测方法的比较。
| 检测方法 | MTT 法 | XTT 方法 | WST-1 方法 | CCK 8 方法 |
|---|---|---|---|---|
| 甲臜产品的水溶性 | 低（需加有机溶剂溶解后再检测） | 高的 | 高的 | 高的 |
| 产品特性 | 粉末 | 2瓶溶液 | 解决方案 | 1瓶溶液 |
| 使用方法 | 混合成溶液并使用 | 该溶液在使用前立即制备。 | 开箱即用 | 开箱即用 |
| 检测灵敏度 | 高的 | 非常高 | 非常高 | 高的 |
| 检测 时间 | 长的 | 短的 | 短的 | 最短 |
| 检测波长 | 560-600 纳米 | 420-480 纳米 | 420-480 纳米 | 430-490 纳米 |
| 细胞毒性 | 毒性大，细胞形态完全消失 | 低毒性，细胞形态不变 | 低的 毒性，细胞形态不变 | 低毒性，细胞形态不变 |
| 试剂稳定性 | 一般的 | 低的 | 一般的 | 高的 |
| 大宗样品测试 | 可行的 | 合适的 | 合适的 | 合适的 |
2.酚红和血清不干扰CCK-8检测。
3.由于CCK-8试剂的细胞毒性很低，因此可以通过加入CCK-8试剂后在不同时间用酶标仪反复读数来确定最佳测定时间。
运输和储存
产品在-25~-15℃干燥避光处可保存两年。
防范措施
1. 在第一次实验中，建议确定最佳接种细胞数和CCK-8试剂最佳孵育时间。
2. 尽量使用多道移液器，以减少重复孔之间的差异。实验中避免产生气泡，因为气泡会干扰 OD 读数。添加 CCK-8 试剂时，建议将其靠近培养板壁添加，而不是将其插入培养基中。
3.白细胞可能需要更长的孵育时间。
4. 使用标准96孔板时，接种细胞数至少为1,000细胞/孔（100 μL），由于白细胞检测灵敏度较低，建议接种细胞数至少为2,500细胞/孔（100 μL）。若使用24孔板或6孔板，计算每孔对应的细胞数，并加入相应体积的CCK-8试剂（加入的CCK-8试剂体积为板每孔培养基体积的10%）。
5.如果没有450nm滤光片，可以使用吸光度在430-490nm之间的滤光片，但450nm滤光片可以实现最高的检测灵敏度。
6、酚红不影响测定，可用减去空白组的吸光度来消除培养基中酚红的吸光度。
7.为了您的安全和健康，操作实验时请穿着实验服，佩戴一次性手套。
指示
一、制作标准曲线
1. 制备细胞悬浮液，测定细胞密度，然后将细胞接种于平板上。
2.按一定的比例（如1：2的比例）依次用培养基稀释细胞，形成细胞浓度梯度，一般3-5个细胞浓度梯度，每个浓度3-6个重复孔。
3. 细胞铺板后，培养2-4小时，使其贴壁，加入CCK-8试剂，孵育一定时间，测定OD值，以细胞数为横轴，OD值为纵轴绘制标准曲线，根据此标准曲线可测定未知样品中的细胞数（使用此标准曲线的前提是实验条件一致）。
II. 细胞活力测定
1. 将细胞（100 μL/孔）放入96孔板中。将板放入培养箱中（37°C，5% CO2) 进行一段时间的预孵化。
2. 每孔加入10 μL CCK-8 试剂（注意不要让气泡进入孔中，否则会干扰 OD 读数），轻轻混匀。
3. 将培养板放入培养箱中，孵育 1-4 小时。
4. 使用微孔板读数仪测量 450 nm 处的吸光度。
5. 若不立即测定OD值，可每孔加入10 μL 0.1 M HCl溶液或1% w/v SDS溶液，盖好板，室温避光保存，24小时内吸光度值不会发生变化。
III. 细胞增殖和细胞毒性测定
1. 将细胞（100 μL/孔）放入96孔板中。将板放入培养箱中（37°C，5% CO2) 进行 24 小时的预孵育。
2. 将10 μL不同浓度的待测物质加入到板中。
3.将培养板放入培养箱中，培养一定时间（如6、12、24或48小时）。
4. 每孔加入10 μL CCK-8 试剂（注意不要让气泡进入孔中，否则会干扰 OD 读数），轻轻混匀。
5. 将培养板放入培养箱中，孵育 1-4 小时。
6. 使用微孔板读数仪测量 450 nm 处的吸光度。
7. 若不立即测定OD值，可每孔加入10 μL 0.1 M HCl溶液或1% w/v SDS溶液，盖好板，室温避光保存，24小时内吸光度值不会发生变化。
笔记： 如果物质具有氧化性或还原性，则在加入CCK-8试剂之前，将旧培养基更换为新鲜培养基（去除旧培养基，用新鲜培养基洗涤细胞两次，然后加入新鲜培养基），以消除该物质的作用。如果物质本身只有 一个 轻微 对吸光度值的影响，不需要更换培养基，用该物质的空白组吸光度值减去即可消除该物质的影响。
计算公式
细胞存活率=[(AC)/(BC)] x100%
抑制率=[(BA)/(BC)]x100%
A：实验组吸光度（含细胞、CCK-8试剂、待测物质的培养基吸光度）
B：对照组吸光度（含细胞的培养基吸光度，CCK-8试剂）
C：空白组吸光度（含CCK-8试剂的培养基吸光度）
引用
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