Annexin V-EGFP/PI细胞凋亡检测试剂盒采用EGFP标记的Annexin V作为探针，检测早期细胞凋亡的发生。
检测原理为：在正常活细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）位于细胞膜内侧，但在凋亡早期细胞中，PS从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露于细胞外环境中。Annexin-V是一种Ca²⁺ 依赖性磷脂结合蛋白，分子量为35～36kDa，能与PS高亲和力结合，磷脂酰丝氨酸可通过细胞外部暴露的磷脂酰丝氨酸与早期凋亡细胞膜结合。
此外，还提供碘化丙啶（PI）以区分存活的早期细胞与坏死或晚期凋亡细胞。PI 是一种核酸染料，它不能穿过正常细胞或早期凋亡细胞的完整细胞膜，但可以穿过晚期凋亡和坏死细胞的细胞膜，使细胞核变红。因此，当 Annexin V 与 PI 结合时，PI 被排除在活细胞之外（Annexin V^-/PI^-）和早期凋亡细胞（Annexin V⁺/PI^-晚期凋亡和坏死细胞对EGFP和PI（Annexin V⁺/PI⁺）。
该试剂盒适用于流式细胞术和荧光显微镜检查。

产品组件

运输和储存

组件附带冰袋，可在-20°C 避光保存，避免反复冻融，保存期为 1 年。
【注意事项】：若短期内需重复使用，可4℃避光保存，保存期为半年。

注意事项

1) 由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议在染色后 1 小时内对样本进行分析。
2) 对于贴壁细胞，消化是关键步骤。消化液中请勿使用 EDTA，因为 EDTA 会影响 Annexin V 与 PS 的结合。
3) 应使用 Annexin V-FITC 固定细胞，例如同时检测细胞凋亡和细胞周期，而不能使用 Annexin V-EGFP，因为 EGFP 在固定过程中会变性并失去激发荧光的能力。固定前将细胞与 Annexin V-FITC 一起孵育，并用 Binding Buffer 洗去未结合的 Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片，这些碎片会与 Annexin V 结合并干扰结果。
4) 如果样本是血液，一定要从血液中去除血小板。因为血小板中含有PS，PS可与Annexin V结合，干扰结果。可以使用含EDTA的缓冲剂在200g下离心，洗去血小板。
5)开盖前请先短暂离心试剂，并将盖子内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体喷洒。
6) Annexin V-EGFP和PI为光敏物质，操作时请避开光照。
7)仅供研究使用！

指示

实验设计
空白管：以未添加Annexin V-EGFP和PI Staining Solution的阴性对照细胞进行电压调节。
单染管：仅补充有 Annexin V-EGFP 的阳性对照细胞用于调节补偿。
检测管：用Annexin V-EGFP和PI染色液处理细胞，通过调整空白管和单染管的参数得到实验数据。
1.1 样品染色
1)悬浮细胞： 在 4°C 下以 300 g 离心 5 分钟来收集细胞。
贴壁细胞：用不含EDTA的胰蛋白酶消化后，4℃、300g离心5分钟收获细胞。胰蛋白酶消化时间不宜过长，以防止出现假阳性。
2)用预冷的PBS清洗细胞两次，每次300g，4℃离心5分钟。
3) 用1×Binding Buffer重悬细胞，调整浓度为1~5×106/mL。
4) 取100 μL细胞悬液加入5 mL流式细胞仪管中，加入5 μl Annexin V-EGFP，混匀，室温避光孵育5分钟。
5) 加入10 μl PI溶液和400 μl PBS，立即染色。
【注意事项】：用流式细胞仪检测细胞凋亡时，PI受时间影响较大，时间过长会导致PI染色增加，因此流式细胞仪检测应在1小时内完成。
1.2 流式细胞术分析
EGFP的最大激发波长为488nm，最大发射波长为507nm；PI-DNA复合物的最大激发波长为535nm，最大发射波长为615nm。采用CellQuest等软件进行分析，绘制双色点图，EGFP为横坐标，PI为纵坐标。每个样本收集10000个事件。在典型的实验中，细胞可分为三个亚群，活细胞只有非常低强度的背景荧光，早期凋亡细胞只有强的绿色荧光，晚期凋亡细胞有绿色和红色荧光双染。