Annexin V-Alexa Fluor488/PI凋亡检测试剂盒的检测原理为：在正常活细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）位于细胞膜内侧，但在凋亡早期细胞中，PS从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露于细胞外环境中。Annexin-V是一种Ca²⁺ 依赖性磷脂结合蛋白，分子量为35～36KD，与PS有很高的亲和力，通过暴露在细胞外面的磷脂酰丝氨酸与早期凋亡细胞的细胞膜结合。
此外，还提供碘化丙啶（PI）以区分存活的早期细胞与坏死或晚期凋亡细胞。PI 是一种核酸染料，它不能穿过正常细胞或早期凋亡细胞的完整细胞膜，但可以穿过晚期凋亡和坏死细胞的细胞膜，使细胞核变红。因此，当 Annexin V 与 PI 结合时，PI 被排除在活细胞之外（Annexin V^-/PI^-）和早期凋亡细胞（Annexin V⁺/PI^-）相反，晚期凋亡和坏死细胞对 Alexa Fluor488 和 PI（Annexin V⁺/PI⁺）。

产品组件

运输和储存

这些组件随附冰袋，可以在 -20°C 下保存 1 年。

注意事项

1) 由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议在染色后 1 小时内对样本进行分析。
2) 对于贴壁细胞，消化是关键步骤。消化液中请勿使用 EDTA，因为 EDTA 会影响 Annexin V 与 PS 的结合。
3) 如果样本来自血液，请务必从血液中去除血小板。因为血小板中含有 PS，PS 可与 Annexin V 结合，干扰结果。可以使用含有 EDTA 的缓冲剂，并通过 200 g 离心将血小板洗掉。
4)开盖前请先短暂离心试剂，并将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体喷洒。
5) Annexin V-Alexa Fluor488 和 PI 是光敏物质，操作时应避光。
6)仅供研究使用！

指示

1.1 样品染色
1.a)悬浮细胞： 在 4°C 下以 300 g 离心 5 分钟来收集细胞。
b) 贴壁细胞：用不含EDTA的胰蛋白酶消化后，在4°C下以300g离心5分钟收获细胞。胰蛋白酶消化时间不宜过长，以防止出现假阳性。
2. 用4℃预冷的PBS清洗细胞两次，每次300g，4℃离心5分钟。
3. 加入250 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，调节浓度为1×106/mL。
4. 取100 μL细胞悬液加入5mL流式细胞仪管中，加入5μL Annexin V-Alexa Fluor 488和10 μL PI，轻轻混匀。
5. 反应避光并在室温下放置 15 分钟。
6. 加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀，1小时内进行流式细胞仪检测。
[注意]：为了避免在细胞清洗过程中细胞丢失，可以使用小吸头抽吸液体。
1.2 流式细胞术分析
Alexa Fluor488的最大激发波长为488nm，最大发射波长为519nm；PI-DNA复合物的最大激发波长为535nm，最大发射波长为615nm。利用CellQuest等软件分析绘制以Alexa Fluor488为横坐标、PI为纵坐标的双色点图。每个样本收集10000个事件。
1.3 荧光显微镜分析
1) 将一滴经 Annexin V-FITC/PI 双染的细胞悬液滴于载玻片上，并用盖玻片覆盖细胞。
2)在双色滤光片荧光显微镜下观察，Annexin V-FITC荧光信号为绿色，PI荧光信号为红色。