细胞凋亡时，内切酶激活，将基因组DNA在核小体之间切断。细胞凋亡过程中DNA提取后，电泳检测发现180-200bp的DNA梯状条带。
TUNEL（TdT介导的dUTP缺口末端标记）凋亡检测试剂盒（Alexa Fluor 488）可用于检测组织细胞凋亡后期过程中的核DNA碎片化，其原理是在末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）作用下，Alexa Fluor 488-12-DUTP掺入基因组DNA断裂时暴露的3'-羟基（3'-OH）末端，从而可通过荧光显微镜或流式细胞术检测。
Alexa Fluor 488 染料更稳定，信号更强，从而产生更亮的标记和更强的抗淬灭性。
该试剂盒适用范围广泛，可用于检测冰冻或石蜡切片中的细胞凋亡，以及培养的贴壁或悬浮细胞中的细胞凋亡。

产品组件

运输和储存

这些组件随附冰袋，可在 -20°C 下保存 1 年。

注意事项

1.需自行准备PBS用于洗涤细胞，抗荧光猝灭液用于封片，4%多聚甲醛用于固定。

2.仅供研究使用！

指示

1. 样品制备
1.1 石蜡包埋组织切片
1.1.1.将石蜡组织切片放入二甲苯中，室温下浸泡5分钟，重复1次，以彻底去除石蜡。
1.1.2.将切片浸泡在100％乙醇中，室温下5分钟，重复一次。
1.1.3.室温下，用梯度乙醇（90，80，70%）浸泡样品，每次3分钟。
1.1.4.用PBS轻轻冲洗切片，用滤纸小心吸干载玻片上样本周围多余的液体。此时可用石蜡笔或疏水笔在样本周围勾勒出样本分布的轮廓，方便后续的通透性处理和平衡标记操作。实验过程中不要让样本干燥。将处理好的样本放入湿盒中，保持样本湿润。
1.1.5.2 mg/mL蛋白酶K溶液用PBS按1:100的比例稀释，达到终浓度为20 μg/mL。
1.1.6.每个样品加入100 μL浓度为20 μg/mL的蛋白酶K溶液至完全覆盖，室温下孵育20分钟。
【注意事项】：蛋白酶K有助于组织和细胞在后续步骤中对染色试剂具有渗透性。孵育时间过长会增加后续洗涤步骤中组织切片从载板上脱落的风险，孵育时间过短则可能造成渗透性处理不充分，影响标记效率。为获得更好的结果，可能需要优化蛋白酶K的孵育时间。
1.1.7.用PBS溶液冲洗样品2-3次，轻轻吸去多余液体，用滤纸仔细吸干载玻片上样品周围的液体。将处理好的样品放入湿盒中，保持样品湿润。
1.2 组织冰冻切片
1.2.1.取出冷冻切片，恢复至室温。将载玻片浸入4％多聚甲醛溶液（溶于PBS）中，固定并在室温下孵育30分钟。
1.2.2. 轻轻去除多余的液体，并用滤纸仔细吸干载玻片上样品周围多余的液体。
1.2.3. 将载玻片浸入PBS溶液中，室温下孵育15分钟，然后用PBS再次清洗共2次。
1.2.4. 轻轻吸去多余液体，用滤纸小心吸干载玻片，去除样品周围多余的液体。此时可用石蜡笔或疏水笔在样品周围勾勒出样品分布轮廓，方便后续渗透处理和平衡标记操作。实验过程中，不要让样品干燥，将处理好的样品放入润湿盒中，保持样品湿润。
1.2.5. 将2 mg/mL蛋白酶K溶液用PBS以1：100的比例稀释至终浓度为20 μg/mL。
1.2.6. 每个样品加入100 μL浓度为20 μg/mL的蛋白酶K溶液至完全覆盖样品，室温下孵育10分钟。
【备注】：蛋白酶K可帮助组织和细胞在后续步骤中对染色试剂进行通透处理。孵育时间过长会增加后续洗涤步骤中组织切片从载板上脱落的风险，孵育时间过短则可能造成通透处理不充分，影响标记效率。若未获得较好的效果，可能需要优化蛋白酶K的孵育时间。
1.2.7. 将样品放入盛有PBS溶液的开口烧杯中冲洗2-3次。
【注意事项】：为避免清洗步骤中样本剥离造成损失，建议不要清洗瓶子，而是将载玻片浸泡在PBS溶液中2-3次进行清洗。
1.2.8. 轻轻除去多余的液体，并用滤纸仔细吸干载玻片上样品周围的液体。将处理好的样品放入湿盒内，以保存样品的水分。
1.3 细胞爬行片的制备
将贴壁细胞培养于Lab-Tek Chamber Slides上，进行凋亡诱导处理后，用PBS清洗载玻片两次。
1.4 细胞涂片的制备（以聚赖氨酸包被的玻片为例）
1.4.1. 将细胞悬浮于PBS中，浓度约为2×107细胞/mL，吸取50~100μL细胞悬液于聚赖氨酸包被的载玻片上，用干净的载玻片将细胞悬液轻轻铺开。
1.4.2. 固定细胞，将载玻片浸入含有新鲜配制的4%多聚甲醛的PBS染色槽中，4℃放置25分钟。
1.4.3. 洗净载玻片，浸入PBS中，室温放置5分钟，再用PBS清洗。
1.4.4. 轻轻吸去多余的液体，用滤纸小心地吸干载玻片，以除去样品周围多余的液体。此时可用石蜡笔或疏水笔在样品周围勾勒出样品分布情况，以方便后续的渗透性处理和平衡标记操作。实验过程中，不要让样品干燥，将处理好的样品放入湿盒中，保持样品湿润。
1.4.5. 将2 mg/mL蛋白酶K溶液用PBS以1：100的比例稀释至终浓度为20 μg/mL。
1.4.6. 每个样品加入100 μL浓度为20 μg/mL的蛋白酶K溶液，使之完全覆盖，室温孵育5 min（也可将其浸入用PBS配制的0.2%Triton X-100溶液中，室温孵育5 min，进行通透性处理）。
【备注】：蛋白酶K可帮助组织和细胞在后续步骤中对染色试剂进行通透处理。孵育时间过长会增加后续洗涤步骤中组织切片从载板上脱落的风险，孵育时间过短则可能造成通透处理不充分，影响标记效率。若未获得较好的效果，可能需要优化蛋白酶K的孵育时间。
1.4.7. 用PBS冲洗样品2-3次，轻轻吸去多余液体，用滤纸小心吸干载玻片上样品周围的液体。将处理好的样品放入湿盒中。
2. 阳性对照的 DNase 处理步骤
样品渗透后， 用 DNase I 处理细胞以制备阳性对照载玻片。此过程通常会导致大多数细胞 经过处理后呈现绿色荧光。
[注释]：Dnase I处理固定化细胞会导致染色体DNA断裂，产生许多可标记的DNA 3'端。
2.1.用去离子水按1:10的比例稀释10×DNase I Buffer（每个样品需要200 µL 1×DNase I Buffer，即20 µL 10×DNase I Buffer和180 µL去离子水进行稀释）。取100 µl滴加到透性样品中，室温孵育5min。在剩余的100 µL 1×DNase I Buffer中加入1 µL DNase I（1U/µL），使终浓度为10 U/mL。
2.2.轻轻拍去液体，然后加入100μL含10U/mL DNase I的缓冲液，室温下孵育10分钟。
2.3.轻拍载玻片以去除多余的液体，然后用去离子水在染槽中彻底清洗载玻片3-4次。
[注意]：阳性对照玻片必须使用单独的染色槽，否则阳性对照玻片上残留的 DNase I 可能会在实验玻片上引入高背景。
3. 标记与检测
3.1.平衡缓冲液（5×平衡缓冲液）用去离子水按1:5的比例稀释（每个样品需要100μL 1×平衡缓冲液）。
3.2. 每份样本加入平衡缓冲液（100μL 1× 平衡缓冲液）使面积完全平衡，室温孵育 10-30 分钟。或者，将玻片放入含有 1 x 平衡缓冲液的 VAT 中，以确保玻片平衡。在冰上解冻 Alexa Fluor 488-12-DUTP Labeling Mix 并平衡细胞，并根据表 1 为所有实验和可选的阳性对照反应准备足够的 TdT 孵育缓冲液。对于面积小于 5 cm2 的标准反应，体积为 50 μl，将 50 μl 乘以实验和阳性对照反应的数量，以确定所需的 TdT 孵育缓冲液总体积。对于表面积较大的样本，试剂体积可按比例增加。

表 1 为实验准备的 TdT 孵育缓冲液和可选的阳性对照反应

[阴性对照体系]：配制不含TdT酶的对照孵育缓冲液，用ddH2O代替TdT酶。
3.3. 用吸水纸将平衡区域周围的100 μl 1× Equilibration Buffer 大部分洗掉，然后将50 μl TdT incubation Buffer 加入到5 cm2 细胞区域。不要让细胞变干。之后，应将载玻片避光。
3.4. 用塑料盖玻片盖住细胞，确保试剂分布均匀，并在湿盒底部放置一块用水浸湿的纸巾。将载玻片放入湿盒中，在 37 ℃ 下孵育 60 分钟。用铝箔纸包裹湿盒，以防光照。
[注意]：塑料盖玻片使用前可以剪成两半，折叠盖玻片边缘，方便取下和操作。
3.5. 取下塑料盖玻片，将切片放入PBS溶液中室温孵育5分钟，然后用新鲜PBS清洗切片两次。
3.6. 用滤纸轻轻擦拭样品周围和背面的 PBS 溶液。
[注]：为了降低背景，用PBS清洗载玻片一次后，可以用含有0.1％Triton X-100和5mg / mL BSA的PBS清洗3次，每次5分钟，以使游离的未反应的标记物清晰干净。
3.7. 样品放入染色槽中染色，载玻片放入装有PI溶液（1 μg/mL，新鲜配制并用PBS稀释）的染色槽中避光、室温下放置5分钟。（可选）：样品放入染色槽中染色，载玻片放入装有DAPI溶液（2 μg/mL，新鲜配制并用PBS稀释）的染色槽中避光、室温下放置5分钟。
3.8.清洗样品，将载玻片浸入去离子水中，室温下放置 5 分钟。重复两次，共清洗三次。
3.9. 将载玻片上多余的水分敲干，并向样品区域添加100 μl PBS，以保持样品湿润。
3.10. 样本立即在荧光显微镜下分析，用标准荧光滤光装置在520±20nm处观察到绿色荧光，在>620nm处观察到PI的红色荧光，或在460nm处观察到蓝色DAPI。如有必要，可将载玻片在4℃避光条件下保存过夜。
[注]: PI/DAPI 可将凋亡和非凋亡细胞染成红/蓝，并且仅在凋亡细胞核中才掺入 Alexa Fluor 488-12-DUTP 并局部出现绿色荧光。
4. 流式细胞仪检测悬浮细胞
4.1. 将3~5×106个细胞用PBS在4℃离心（300×g）两次，再在4℃以300g离心10分钟，然后用0.5 mL PBS重悬。
4.2. 固定细胞，加入5 mL PBS 配制的1%多聚甲醛溶液，冰上放置20 min。
4.3. 细胞在4℃下以300×g离心10分钟，除去上清液，并用5 mL PBS重悬。重复洗涤一次，并用0.5 mL PBS重悬细胞。
4.4. 细胞透化，加入5 mL冰预冷的70%乙醇，-20℃孵育4小时。细胞可置于-20℃的70%乙醇中保存一周，或用PBS配制的0.2%Triton X-100溶液进行细胞透化，室温保存5分钟。
4.5. 细胞以 300 × g 离心 10 分钟，并悬浮于 5 mL PBS 中。重复离心，并悬浮于 1 mL PBS 中。
4.6. 将 2×106 个细胞转移至 1.5 ml 微量离心管中。
4.7. 平衡液以300×g离心10分钟，弃上清，加入80 μL 1×Equilibration Buffer重悬，室温孵育5分钟。
4.8. 平衡细胞的同时，将Alexa Fluor 488-12-DUTP Labeling Mix在冰上融化，按照表1配制足够所有反应的TdT孵育缓冲液。标准反应2×106个细胞，体积为50 μL，50 μL乘以反应次数即为所需的TdT孵育缓冲液总量。
4.9. 300×g离心细胞10分钟，弃上清，将沉淀重悬于50μL TdT孵育缓冲液中，37℃避光孵育60分钟，每隔15分钟用微量移液器轻轻重悬细胞一次。
4.10.加入 1 mL 20 mM EDTA 并用微量移液器轻轻混合以终止反应。
4.11. 300g 离心 10 min，弃上清，将沉淀重悬于 1 mL 用 PBS 制备的 0.1% Triton X-100 溶液中，该溶液含有 5 mg/mL BSA。重复该溶液一次，共洗涤两次。
4.12. 300 g 离心 10 min 弃上清，将细胞重悬于 0.5 mL 用 PBS 新配制的 5 μg/mLPI 溶液中，该溶液含有 250 μg 无 DNase 的 RNase A。
4.13. 将细胞在室温下黑暗中孵育 30 分钟。
4.14.流式细胞仪检测细胞，在520±20nm处可见绿色荧光，在>620nm处可见PI的红色荧光，PI可将凋亡细胞和非凋亡细胞染成红色，仅在凋亡细胞核中可见Alexa Fluor 488-12-DUTP掺入并局部呈现绿色荧光。