指示

1. 实验前准备

1） 准备好实验所需的试剂和材料。

2）确认适用性 qPCR 仪器

该试剂盒可在以下类型的qPCR仪器上使用：

1. Bio-Rad：CFX96
2. Thermo Scientific：7500实时PCR系统；QuantStudio™5；
3. 实验方法

1） DNA提取

我们建议使用 ‘ 磁性残留 DNA 样本制备试剂盒' （目录号 18461ES 手动提取和 货号：18462ES 自动提取） DNA提取， 你 能 访问 ‘ http://www.yeasenbiotech.com ‘  为了 这

详细信息和购买。

该试剂盒（Cat#40619ES）含有内参（IC）。如果在 DNA 提取之前将 IC 添加到样本中，则可以验证整个过程（包括 DNA 提取和 qPCR 反应）。如果将 IC 添加到 qPCR 主混合物中

直接地， IC 仅作为 qPCR 控制。

2）qPCR Mix 制备

1. 根据样本量，包括阳性对照（PCS）、无模板对照（NTC）、阴性对照  对照溶液（NCS）和测试样品（TS）计算反应次数。平行制备2个反应

一般情况下每个样本都是这样的。

* PCS：正极 控制 溶液；NTC：无 模板 对照；NCS：阴性 控制 解决方案；TS：测试 样品。有 是 不 需要 到 履行

这 样本 萃取 为了 件 和 NTC，但 国家计算机系统公司 和 TS 是 需要。

反应孔（M1）=（1×NCS + （N×TS） ×2

反应孔（M2）=（1×PCS + 1×NTC） ×2

反应孔（M3）=（1×PCS + 1×NTC+ N×TS） ×2

1. 根据实验设计和下表，在冰上预解冻所需量的试剂。
2. 根据反应次数计算qPCR Mix的用量。请注意，如果试剂盒将用于产品发布等GMP活动，我们建议使用表1和表2进行配制；如果 该套件将 只是 用于研究，且在评估后提取前无需添加IC，则按照表3进行

准备。请注意，并非所有 M1、M2 和 M3 是 需要 是 准备。

表 1 M1 的 qPCR Mix 体系

*这 配置 系统 在 桌子 1 是 基于 在 这 前提 那 我知道了 是 额外 前 萃取 为了 两个都 国家计算机系统公司 和 TS，所以 它 是 不是 必要的

到 添加 我知道了 什么时候 定量PCR 混合 制备。IC 添加 方法 前 萃取： 首先，稀释 我知道了 经过 20次 和 脱氧核糖核酸 稀释剂，以及 添加 1微升

稀 我知道了 进入 每个 100μL 测试 样本 为了 这 更远 萃取。

**这 成套工具 做 不是 包含 氧化还原酶 参考 染料。 如果 氧化还原酶 参考 染料 是 需要 为了 这 真实的 时间 聚合酶链反应 放大器 那 你 是 现在 使用， 50×ROX 参考 染料 （货号：10200ES）是 受到推崇的 为了 使用。 在 这 案件 额外 体积 是 0.8μL， 作为 显示 在 桌子 1. 如果 使用 其他

品牌 的 氧化还原酶 产品，请 参考 到 他们的 指示 为了 氧化还原酶 添加。如果 不 氧化还原酶 参考 染料 是 需要， 额外 体积 是 0 μL。

表 2 M2 的 qPCR Mix 体系

*这 配置 系统 在 桌子 2 是 基于 在 这 前提 那 我知道了 是 不是 额外 在 件 和 负温度系数 (NTC) 前 萃取， 所以 我知道了 需求 到 是 额外 期间 定量PCR 混合 制备。IC 添加 方法 后 萃取： 稀 我知道了 经过 100次 和 脱氧核糖核酸 冲淡 和 添加 1微升 稀 我知道了 进入

每个 定量PCR 混合 系统。

**这 成套工具 做 不是 包含 氧化还原酶 参考 染料。 如果 氧化还原酶 参考 染料 是 需要 为了 这 真实的 时间 聚合酶链反应 放大器 那 你 是 现在 使用， 50×ROX 参考 染料 （货号：10200ES）是 受到推崇的 为了 使用。 在 这 案件， 额外 体积 是 0.8μL， 作为 显示 在 桌子 1. 如果 使用 其他

品牌 的 氧化还原酶 产品，请 参考 到 他们的 指示 为了 氧化还原酶 加法。如果 不 氧化还原酶 参考 染料 是 需要， 额外 体积 是 0 μL。

表 3 M3 的 qPCR Mix 体系

*这 配置 系统 在 桌子 3 是 基于 在 这 前提 那 我知道了 是 不是 额外 到 样品 前 萃取，所以 我知道了 需求 到 是 额外    期间 定量PCR 混合 制备。IC 添加 方法 后 萃取： 稀 我知道了 经过 100次 和 脱氧核糖核酸 冲淡 和 添加 1微升 进入 每个 定量PCR 混合

系统。

**这 成套工具 做 不是 包含 氧化还原酶 参考 染料。 如果 氧化还原酶 参考 染料 是 需要 为了 这 真实的 时间 聚合酶链反应 放大器 那 你 是 现在 使用， 50×ROX 参考 染料 （货号：10200ES）是 受到推崇的 为了 使用。 在 这 案件 额外 体积 是 0.8μL， 作为 显示 在 桌子 1. 如果 使用 其他

品牌 的 氧化还原酶 产品，请 参考 到 他们的 指示 为了 氧化还原酶 加法。如果 不 氧化还原酶 参考 染料 是 需要， 额外 体积 是 0 μL。

3）模板添加

1. 将 qPCR 混合物充分摇晃，低速离心，并从盖子中收集残留液体

到底部 管子。

1. 添加 20 μL qPCR Mix 加入每个反应管/孔中。请注意将相应的 qPCR Mix 加入每个

样品管并避免添加错误。

1. 将模板添加到含有 qPCR Mix 的管/孔中。有关模板添加的信息，请参阅表 4。

桌子 4 个模板 添加

*我们建议使用 DNA 稀释缓冲液 (40619-E) 作为 NCS 模板进行 DNA 提取。

**这 全部的 反应 体积 在 每个 管/孔 是 40 μL。

***覆盖 这 管子 盖 或者 这 盘子 电影。至 避免 影响 这 荧光 信号 请阅读 拿 关心 不是 到 标记 这 管子 盖 或者 电影

或者 甚至 擦 这 电影 反复 和 一个 刮刀。

****离心机 这 反应 管子 或者 盘子 简要地 在 低的 速度 后 模板 添加。 后 充足的 摇晃 和 搅拌，重复 离心机

在 低的 速度 到 收集 这 液体 从 这 盖 或者 墙 到 这 底部。避免 气泡 什么时候 操作。 基线 将要 是 受到影响 如果 这 混合

是 不是 混合 好吧，那么 这 步 是 非常 重要的 到 一个 好的 实验 结果。

4）qPCR程序设置

1. 程序文件设置

示例（7500 实时 PCR 系统仪器和实时 PCR 软件 v2.4）：

仪器型号：7500 (96孔板)

实验类型：定量-标准曲线；

化学：Taqman® 试剂

升温速度：标准（约 2 小时完成一次运行）

1. 目标渠道设置

在 “定义 目标 和 样品” 的 “盘子 设置”， 创造 一个 目标 1 渠道 （家庭与家庭用品）， 选择 法姆 作为 这 报告 荧光基团和 MGB 或 没有任何 作为淬火 荧光 团体。 创造 一个 目标 2 渠道 （维多利亚州）， 选择 这 报告 荧光 团体 作为 维多利亚州 和 这 淬火 荧光 团体 作为 没有任何。 在 “分配 目标 和 样品” 的 “盘子 设置”， 如果 不 额外的 氧化还原酶 染料 是 已添加，选择 “没有任何”; 如果 额外的 氧化还原酶 是 已添加，选择

韓氏。

1. 标准扩增程序设置

表5 标准扩增程序设置

1. 基线和阈值设置：

原则 的 基线 调整： 使用 这 自动的 基线 一般来说。 如果 需要 到 调整 在 手动的， 选择 这 循环 在指数增长之前 周期作为起始周期，避开波动区 最初的 荧光 收集。选择最早出现指数扩增的样本Ct值前1-2个循环作为

终点。

原则 的 临界点 调节：一般采用自动阈值调节，若需要手动调节，则阈值 应该 是 放 更高 比 这 消极的 样本 或者 这 基线 噪音， 它是 一般来说 放 门槛 在 这 晚的

阶段 每个隧道需要指数放大、相对独立、合适的阈值。

5） 结果 分析

1. PCS、NTC、NCS的结果判断：

如果添加IC：每个控制样品的规格应为 满足表6：

桌子 6 结果 判断 的 封装, 负温度系数 和 国家计算机系统公司

若未添加IC:每个质控样品均应符合表6中FAM信号栏的规定,且

需要分析 VIC 通道。

1. TS结果判断

先决条件： 它 是 是否需要确定 件， NTC 和 国家计算机系统公司 通过了规范 在表格中 6 TS 之前 结果分析。 如果通过，则可以 继续 下一步。 如果不 已通过， 这 TS 结果 可能 不是 是 可靠的， 和

需要调查原因。

如果添加IC：找到相应结果 根据FAM的结果信息进行判断，并 维多利亚州 表7中：

桌子 7：结果 判断 的 TS （我知道了 额外）

*如果 那里 是 抑制 为了 维多利亚州 信号、治疗 是 需要 到 排除 这 抑制剂 或者 重复 这 测试。

若未添加IC：查找相应结果 根据判断 FAM结果信息见表8 ，并且不需要分析 VIC 信号。

桌子 8：结果 判断 的 TS （我知道了 不是 额外）

笔记

1. 使用该试剂盒前请仔细阅读本说明书，实验应以规范的方式进行，包括样品处理、反应体系的制备、样品的添加等。

2. 尽可能在冰上进行样品添加和试剂制备操作。
3. 使用前，请将每种试剂旋涡并混匀。

4. 请穿戴工作服和一次性手套进行操作， 您的安全。
5. 本产品仅供研究使用。