维罗 宿主细胞DNA残留检测试剂盒用于各类生物制品中间样品、半成品及成品中Vero宿主细胞DNA残留量的定量分析。

本试剂盒采用Taqman荧光探针和聚合酶链式反应（PCR）方法，最低检测限为fg级，可特异、快速地检测出Vero细胞中残留的DNA，本试剂盒需与残留DNA样本制备试剂盒（Cat# 18461ES）配合使用。

产品 成分

^*IC：内部控制

运输和储存

1. 使用干冰运输 并储存于-20°C 2 人份 年

2. 收到货后，请立即检查并存放于相应的储藏温度。

注意事项

1. 使用该试剂前请仔细阅读本说明书，实验应规范化，包括样品处理、反应体系制备及样品的添加。

2. 最好在冰上添加样品和制备溶液。

3. 确保每个组分在使用前都充分涡旋并以低速离心。

4. 为了您的安全和健康，操作时请穿着工作服和戴一次性手套。

5. 本产品仅供研究使用！

适用仪器型号

包括但不限于：

Bio-Rad： CFX96光学模块。

热电科技： ABI 7500； ABI Quant Studio 5； ABI 步骤 OnePlus。

使用说明

1. 维罗 DNA标准稀释及标准曲线制作

维罗 使用试剂盒中提供的 DNA 稀释缓冲液对 DNA 对照进行梯度稀释， 稀释浓度分别为300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL、3 平均每克

请参阅下面的详细说明：

1.1 解冻 维罗 DNA 对照和 DNA 稀释缓冲液置于冰上。 完全解冻后，轻轻涡旋混匀，低速离心 10 秒。

1.2 取出六个 干净的1.5 mL试管，标有3 ng/μL、①、②、③、④、⑤、⑥。

1.3 加入90 μL DNA稀释缓冲液和10 μL Vero DNA 控制 到 1.5 mL 微量离心管，标记为 3 ng/μL，稀释至 3 ng/μL，混匀后离心10秒，将稀释后的DNA标准品分装，可在-80℃短期保存（不超过3个月），请避免反复冻融。

1.4 将 90 μL DNA 稀释缓冲液加入其他 管，然后按照以下步骤进行连续稀释。

[笔记]：

1. 每个浓度需要三个复孔。检测范围为 3 fg/μL～300pg/μL 和 如果需要的话，可以扩大该范围。

2. 为了减少重复冻融的次数，避免污染，建议将 DNA 对照储存在 首次在-80°C 下分装。

3. 解冻后，DNA稀释缓冲液可以 储存于2-8°C 保存期为7天，如长期不使用，请存放于-20°C。

4. 确保模板完全混合，轻轻摇晃混合物 15 秒至 1 分钟 对于每个梯度稀释。

2. 提取回收控制 (ERC) 准备

设定浓度 维罗 ERC 中的 DNA 根据需要（ERC 样本 （以3 pg/μL DNA为例）制备如下：

2.1 将100 μL测试样品加入干净的1.5 mL管中，然后加入10 μL 3pg/μL Vero DNA Standard（③），混匀，标记为ERC。

2.2 进行 ERC 样本的 DNA 提取 与测试样品一起制备纯化的 ERC 样本。

3. 阳性对照样品 (PCS) 制备（可选）

设定浓度 维罗 PCS 中的 DNA 根据需要（PCS （以3 pg/μL DNA为例）制备如下：

3.1 加入100 μL 3 pg/μL Vero DNA标准品(③) 放入干净的1.5 mL 管中，然后标记为 PCS。

3.2 进行 PCS 的 DNA 提取 与测试样品一起制备纯化的PCS。

4. 消极的 对照溶液 (NCS) 制备

实验中设置阴性对照，具体操作步骤如下：

4.1 加入 100 μL 将样品基质（或DNA稀释缓冲液）倒入干净的1.5 mL管中，然后标记为NCS。

4.2 将NCS样本与检测样本同时进行DNA提取，制备纯化的NCS样本。

5. 无模板对照 (NTC) 制备

设置无模板 实验中控制，具体操作步骤如下：

5.1 NTC无需样品预处理，可配置在qPCR检测残留DNA含量的阶段。

5.2 每管或每孔中NTC样品20 微升 混合（即 16 微升 Vero qPCR 混合物 + 4 μL Vero 引物和探针混合物）+ 20 μL DNA稀释缓冲液。建议配置三个重复孔。

6. PCR反应体系

[笔记]：

1. 根据反应次数计算PCR总反应体积：qPCR Mix=（反应次数+2）×（16+4）μL（包含两个反应孔的损失）。建议每个样本实验重复三次以上。

2. 盖上管盖或封上板后，低速离心反应管或板10秒，充分震荡混匀5秒后，再重复离心，使液体从管盖或管壁收集至底部，操作时避免产生气泡。

请参阅下表以了解推荐的板材设置：

板块布局包括：1 NTC（无 模板 对照）1 国家计算机系统公司 （阴性对照 解决方案）， 6 STD（6 个 标准浓度），3 TS（测试样本），3 ERC（提取回收对照），1 PCS（阳性对照样品）。每个样品设三个重复孔。

7. PCR 仪器设置指南 （两步法）

以下说明仅适用于 Thermo ABI 7500 qPCR 仪器 （软件版本 2.0）。如果您使用不同的仪器，请参阅适用的仪器指南以获取设置指南。

7.1 创建新实验，选择绝对定量或用户自定义的模板。

7.2 在“Define”界面的“Targets”窗格中，添加一个目标并命名为FAM，选择报告基因为“FAM”，猝灭剂为“none”。

7.3 在“样本”窗格中，依次添加所有样本信息。然后选择孔，选择目标和相应的样本。设置Vero的任务 DNA标准为标准，并赋值300000、30000、3000、300、30、3 （每孔DNA浓度单位为fg/μL）在Quantity栏中填写，并将各孔命名为STD 1、STD 2、STD 3、STD 4、STD 5、 STD 6，对应设置NTC的任务为NTC，设置NCS、TS、ERC 和 PCS 为 Unknown，并根据上面的 Plate 布局进行相应的命名。然后点击 Next。

7.4设置扩增程序：设置反应体积为40 μL。

8. qPCR 结果分析

8.1 在Analysis的Amplification Plot面板中，系统会自动给出Threshold，有时系统给出的Threshold过于靠近基线，导致重复孔之间的Ct值相差较大，您可以手动调整Threshold到合适的位置后，点击Analyze，即可在Multicomponent Plot中初步检查扩增曲线是否正常。

8.2 在结果分析选项卡中，查看标准曲线图。验证斜率、Y 截距、R2 的值 和效率。对于正态标准曲线，R²>0.99；90%≤Eff%≤110%。

8.3 在 '查看井表' 在分析窗格中，每个样本的浓度以“定量”显示，单位为fg/μL，可以转换为pg/μL 或检测报告中的 pg/mL。

手册