大肠杆菌 宿主细胞DNA残留检测试剂盒用于大肠杆菌的定量分析 各类生物制品的中间样品、半成品、成品中宿主细胞DNA残留。

本试剂盒采用Taqman荧光探针和聚合酶链式反应（PCR）方法，具有fg级最低检测限，可特异、快速地检测出残留的大肠杆菌 细胞DNA。该试剂盒需与残留DNA样品制备试剂盒（Cat# 18461ES）一起使用。

验证报告

规格

成分

贮存

本产品储存于-25~-15℃，保存期限为2年。

41308-A 和 41308-B 均应避光保存。

适用仪器型号

包括但不限于：

Bio-Rad：CFX96 光学模块。

赛默飞世尔科技：ABI 7500；ABI Quant Studio 5。

指示

1. 大肠杆菌。 DNA标准稀释及标准曲线制作

大肠杆菌 使用试剂盒中提供的 DNA 稀释缓冲液对 DNA 对照进行梯度稀释^*以及稀释

浓度为300pg/μL、30pg/μL、3pg/μL、300fg/μL、30fg/μL。

请参阅下面的详细说明：

• 将 coliDNA control 和 DNA dilution buffer 在冰上解冻，完全解冻后轻轻涡旋混匀，低速离心 10 秒。
• 取出六个干净的 1.5 mL 管，标记为 Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5。
• 将90 μL DNA稀释缓冲液和10 μL coliDNA Control加入到标记为Std0的1.5 mL微量离心管中，即 稀释至3ng/μL，混匀后离心10秒，将稀释后的DNA标准品分装，可在-25~-15℃短期保存（不超过3个月）^**.请避免反复冻融。
• 将 90 μL DNA 稀释缓冲液加入其他管中^***，然后按照以下步骤进行连续稀释^****。

表1 标准梯度稀释

^*每个浓度需要三个重复孔。检测范围为 30 fg/μL~300pg/μL且范围可扩展。

^**为了减少重复冻融次数及避免污染，建议首次将DNA对照分装于-25~-15℃保存。

^***DNA稀释缓冲液解冻后可在2-8°C保存7天，若长期不使用，请保存在-25~-15℃。

^****确保模板完全混合，每个梯度稀释时轻轻摇晃混合物 15 秒至 1 分钟。

2. 提取回收控制 (ERC) 准备

根据需要设定ERC中E.coli DNA的浓度（ERC样品制备30 pg E.coli DNA为例），如下：

• 取100 μL检测样品于一个干净的1.5 mL管中，加入10 μL 3pg/μL E.coli DNA Standard（Std3），混匀，标记为ERC。
• 将ERC样本的DNA提取与测试样本一起进行，制备纯化的ERC样本。

3. 阴性对照溶液 (NCS) 制备

实验中设置阴性对照，具体操作步骤如下：

1) 将100 μL样品基质（或DNA稀释缓冲液）加入到一个干净的1.5 mL管中，然后标记为NCS。

2) 将NCS样本的DNA提取与检测样本同时进行，制备纯化的NCS样本。

4. 无模板对照 (NTC) 制备

实验中设置无模板对照，具体操作步骤如下：

1) NTC不需要样品预处理，可以配置在qPCR检测残留DNA的阶段。

2) 每管或每孔NTC样品为20 μL Mix（即15 μL E.coli qPCR Mix + 5 μL E.coli Primer&probe Mix）+ 10 μL DNA Dilution Buffer。建议配置三个重复孔。

5. PCR反应体系

表2 反应体系

^*根据反应次数计算PCR总反应体积：qPCR Mix=（反应次数+2）×（15+5）μL（包含两个反应孔的损失）。建议每个样本实验重复三次以上。

^**盖上管盖或封上板后，低速离心反应管或板10秒，充分震荡混匀5秒后，再重复离心，使液体从管盖或管壁收集至底部，操作时避免产生气泡。

请参阅下表以了解推荐的板材设置：

表3 电脑上参考板

板布局包括：5个Std（5个标准浓度的标准曲线），1个NTC（无模板对照），1个NCS（阴性对照溶液），3个TS（测试样品），3个ERC（提取回收对照）。每个样品设三个重复孔。

6. 设置 PCR 仪器指南（2步法）（例如：Thermo ABI 7500 qPCR仪，Version 2.0软件）

以下说明仅适用于 Thermo ABI 7500 qPCR 仪器（软件版本 2.0）。如果您使用其他仪器，请参阅适用仪器指南以获取设置指南。

1） 生成新实验，选择绝对定量或用户定义的模板。

2） 创建1个检测探针，命名为“E.coli-DNA”，选择报告荧光团为“FAM”，淬灭荧光团为“None”，参考荧光为“ROX”（参考荧光可根据仪器型号等选择是否需要添加）。

3） 在“样本”窗格中，依次添加所有样本信息。然后选择孔，选择目标和相应的样本。设置E.coli的任务 以DNA标准品为标准品，在Quantity栏中分别赋值300000、30000、3000、300、30（每孔DNA浓度单位为fg/μL），并将各孔命名为Std 1、标准 2、标准 3、标准 4、标准 5、相应设置NTC的任务为NTC，设置NCS、TS、ERC 为 Unknown，并根据上面的 Plate 布局进行相应的命名。然后点击 Next。

4） 设定扩增程序：设定反应体积为30 μL。

表4 扩增步骤

7. qPCR 结果分析

1） 在Analysis的Amplification Plot面板中系统会自动给出Threshold，系统给出的Threshold有时过于靠近基线，导致重复孔之间的Ct值相差较大，您可以手动调整Threshold到合适的位置后点击Analyze，然后可以在Multicomponent Plot中初步检查扩增曲线是否正常。

2） 在“结果分析”选项卡中，查看标准曲线图。验证 R 的值²、效率、坡度 和 Y 截距。对于正态标准曲线，R²>0.99， 90%≤Eff%≤110%，-3.6≤斜率≤-3.1。

3） 在分析中的“查看孔表”窗格中，每个样本的浓度以数量显示，单位为 fg/μL，可以在检测报告中转换单位。

4）结果分析的参数设置需要根据具体机型和使用的软件版本而定，一般可以由仪器自动解读。

5)根据待测样品TS测试结果和样品加标回收率ERC计算加标回收率，要求加标回收率在50%~150%之间。加标回收率测定公式：回收率（%）= {Sample spiked assay (eg.pg/μL) - Sample assay (eg.pg/μL)} x 洗脱体积(μL) / DNA加入量理论值(eg.pg) x 100%。

6)阴性对照NCS的Ct值应大于标准品最低浓度C​​t的平均值。

• 无模板对照NTC应为未确定或Ct值≥3

笔记

1. 本产品仅供研究使用。
2. 为了您的安全，请穿着实验服和戴上一次性手套进行操作。

3.使用该试剂前请仔细阅读本说明书，实验应规范化，包括样品处理、反应体系制备、样品的添加等。

4.使用前确保各组分充分涡旋并低速离心。

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