使用复制型慢病毒 (RCL) 检测试剂盒 定量检测复制慢病毒 可能发生在 与慢病毒相关的多种细胞产品 矢量的潜在风险。

该试剂盒设计了特定的引物 慢病毒包膜蛋白的VSV-G基因序列。 它采用taqman  荧光探针和聚合酶链式反应（PCR）方法，其检测限为1拷贝/μL级， 可以特异性、快速地检测 复制能力慢病毒的风险。该试剂盒需要 一起使用 残留 DNA 样本制备试剂盒（Cat# 18461ES）。

成分

* 我知道了： 内部的 控制。

贮存

本产品应储存于-25~-15℃ 2 人份 年。

41311-A 和 41311-B 均应避光保存。

适用的 乐器 模型

包括但不限于： Bio-Rad：CFX96 光学模块；Thermo Scientific： ABI 7500； ABI Quant Studio 5； ABI 步骤 OnePlus。

指示

1. 克隆的DNA 标准 稀释 和 标准 曲线 准备

使用试剂盒中提供的 DNA 稀释缓冲液对 RCL DNA 对照进行梯度稀释* 以及稀释 浓度为5×10E7 拷贝/μL，5×10E6 拷贝/μL，5×10E5 拷贝/μL，5×10E4 拷贝/μL，5×10E3 拷贝/μL，5×10E2 拷贝/μL， 5×10E1 份/μL。

请参阅下面的详细说明：

1） 在冰上解冻 RCL DNA 对照和 DNA 稀释缓冲液。 完全解冻后， 轻轻旋涡 混合，然后 低速离心 10 秒钟。

2） 取出七只干净的1.5 mL 管，分别标记为 Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5、Std6。

3） 添加 90 μL DNA 稀释缓冲液和 10 将 μL RCL DNA 对照加入标有 Std0 的 1.5 mL 微量离心管中， 即   稀释至 5×10E7 份/μL。混合并 然后离心10秒。将稀释的DNA标准品分装，即可 短期储存（不超过3个月）于-25~-15℃** .请避免反复冻融。

4） 添加 90 μL DNA 稀释缓冲液倒入其他管中*** ，然后按照以下步骤操作 连续稀释**** 。

表1 标准梯度稀释

*三 复制 井 是 必需的 为了 每个 浓度 检测 范围 是 5×10E1 拷贝/μL~5×10E6 份/微升 和 这 范围 能 是 如果需要的话可以进行扩展。

** 到 减少 这 数字 的 重复 冻融 和 避免 污染，它 是 受到推崇的 到 店铺 这 脱氧核糖核酸 控制 在 等分试样 在 -25~-15℃ 为了 这 第一的 时间。

*** 一次 解冻， 脱氧核糖核酸 稀释 缓冲 可以 是 存储 在 2-8℃ 为了 7 天，如果 不是 用过的 为了 一个 长的 请给时间 店铺 在 -25~-15℃ 。

**** 制作 当然 这 模板 是 完全地 混合，轻轻地 摇 这 混合物 为了 15 秒 到 1 分钟 为了 每个 坡度 稀释。

2. 萃取回收 控制 （环境责任委员会） 准备

根据需要设置 ERC 中 RCL DNA 的浓度（ERC 样品用 5×10E4 将 RCL DNA 复制为 举例来说），如下：

1） 添加 100 μL 测试样品放入干净的 1.5 mL 管中，然后加入 10 微升 5×10E3 拷贝/μL RCL DNA 标准 (Std4) 和 混合均匀，标记为ERC。

2） 将ERC样本的DNA提取与测试样本一起进行，制备纯化的ERC样本。

3. 阴性对照 解决方案 （国家癌症中心） 准备

实验中设置阴性对照，具体操作步骤如下：

1） 添加 100 μL 样品基质（或 DNA 稀释缓冲液）倒入干净的 1.5 mL 管中，然后标记为 NCS。

2) 进行 NCS 的 DNA 提取 样品与测试样品一起制备纯化的NCS 样本。

4. 无模板 控制 （NTC） 准备

实验中设置无模板对照，具体操作步骤如下：

1）NTC无需样品预处理，可在qPCR检测残留DNA的阶段进行配置 内容。

2）每管或每孔中NTC样品20 μL 混合液（即 15 μL RCL qPCR 混合物 + 4 微升 雷诺公司 引物和探针 混合 + 1 μL IC）+ 10 μL DNA稀释缓冲液。建议配置三个重复孔。

5. 聚合酶链反应 反应 系统

表2 反应体系

* 计算 这 全部的 聚合酶链反应 反应 体积 经过 这 数字 的 反应：qPCR 混合 =（ 数字 的 反应+2） × (15+4+1) μL（包括 这 损失 两个反应孔）。建议每个样品进行三次以上的重复实验。

** 后 封盖 这 管子 或者 密封 这 板、离心机 这 反应 管子 或者 盘子 在 低的 速度 为了 10秒后 充足的 摇晃 和 混合 为了 5秒，重复 离心机 到 收集 这 液体 从 这 盖 或者 墙 到 这 底部。避免 气泡 期间 手术。

请参阅下表以了解推荐的板材设置：

表3 计算机开机 参考 木板

板布局包括：6 个 Std（6 个标准浓度的标准曲线）、1 个 NTC（无模板对照）、1 NCS（阴性对照溶液）、3TS（测试样品）、3ERC（提取回收对照）。三个重复孔 每个样本。

6. 设置指南 为了 一个 聚合酶链反应 乐器

以下说明仅适用于 热 ABI 7500 qPCR 仪器（软件 版本 2.0）。如果 你使用 不同的仪器，请参阅适用的仪器指南以了解设置指南。

1）生成新实验，选择绝对定量模板或 用户定义。

2) 创建1个检测探针，命名为“RCL-DNA”，选择报告荧光团为“FAM”，淬灭荧光团为 “无”；再创建 1 个检测探针，命名为“IC”，并选择报告荧光团为“CY5”并淬灭 荧光团为“无”。 参考荧光为ROX”（参考荧光可以基于 仪器型号等，选择 无论 您需要添加它）。

3）在 '样本' 窗格，依次添加所有样本信息。然后选择孔，选择目标和 样本的相应设置。 RCL DNA标准的任务作为标准，并分配 值 5000000, 500000, 在 Quantity 栏中分别输入 50000、5000、500、50（每孔 DNA 浓度单位为拷贝数/μL），并将  孔 Std 1、Std 2、Std 3、Std 4、Std 5、Std 6。设置 NTC 的任务为 NTC。将 NCS、TS 和 ERC 设置为 未知，并根据上面的板块布局相应命名。 然后单击下一步。

4)设置扩增程序：设置反应体积为30 μL。

表4 扩增程序

7. 分析 定量PCR 结果

1）系统 将自动给出阈值 扩增图面板 分析。给定的阈值 系统有时过于接近基线，导致差异很大 重复孔之间的 Ct。 您可以手动调整 将阈值调整到适当位置并点击 分析。然后你可以初步检查 多组分图中扩增曲线是否正常。

2）结果 分析选项卡，查看标准曲线图。 验证 R2、效率、斜率和 Y 截距。对于正态标准曲线，R²>0.99，90%≤Eff%≤110%，-3.6≤Slope≤-3.1。

3）在 '看法 好表'窗格中 分析，每个样品的浓度以数量表示， 单位 为拷贝数/μL，单位可在检测报告中换算。

4）参数设置 结果分析需要基于具体的模型和软件 版本 并且通常可以由仪器自动解释。

5) 根据测试结果计算加标回收率 样本 TS 待测量和样品加标 回收率 ERC 需要尖刺 介于50%~150%之间。加标回收率测定公式：

回收率 (%) = {Sample spiked assay (eg.copies/μL) - Sample assay (eg.copies/μL)} x 洗脱体积 (μL) / 理论 DNA添加量值（例如拷贝数） x 100%。

6）CT 的价值 阴性对照 NCS 应该大于平均值 最低浓度 Ct 这 标准。

7） 免模板控制NTC 应为未确定或 Ct 值≥38。

笔记

1. 本产品仅供研究使用。
2. 为了您的安全，请穿着实验服和戴一次性手套进行操作。

3.使用前请仔细阅读本手册 该试剂和实验应标准化，包括 样品处理、反应体系制备和 样品添加。

4.使用前确保各组分充分涡旋并低速离心。

手动的