描述
活性氧物质检测试剂盒使用细胞渗透性试剂 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 (DCFDA) 定量评估活细胞样本中的活性氧物质。亲脂性非荧光 DCFDA 通过被动扩散随后脱乙酰化，很容易穿过细胞膜。脱乙酰化产物是一种对氧化剂敏感的 2',7'-二氯荧光素 (DCHF)。DCHF 随后被 ROS 氧化形成 DCF。DCF 具有强荧光性，可通过荧光光谱法或流式细胞术检测，激发/发射波长为 480 nm/525 nm。Rosup 是一种化合物混合物，是一种 ROS 诱导剂，可用作阳性对照。
产品组件
| 部件编号 | 成分 | 数量 | 贮存 |
| 50101-A | 二甲基二烯丙基胺 （10 毫米） | 100 微升 | -20 摄氏度 |
| 50101-B | 罗苏普 （100 毫米） | 1 毫升 | -20 摄氏度 |
运输和储存
本试剂盒随附冰袋。在-20°C 避光条件下可保存 1 年。避免反复冻融。
申请方法
1. 试剂制备
DCFH-DA 溶液：开封前先低速短暂离心。用无血清培养基稀释 10 mM DCFH-DA，使最终浓度达到 10 μM，从而制备 DCFH-DA 工作溶液。
[注意]：DCFH-DA 也可以在不含酚红的培养基中稀释。使用新鲜制备的 DCFH-DA 溶液，不建议长期储存稀释的 DCFH-DA。所需的 DCFH-DA 的确切浓度取决于所使用的细胞系，但一般起始范围为 10-50 μM。对于某些细胞，如果阴性对照（不含 DCFH-DA 探针）的荧光非常强，则将 DCFH-DA 稀释至 2-5 μM 并缩短孵育时间 适当地。
Rosup 溶液：用无血清培养基稀释 100 mM Rosup 原液，制备 100 µM Rosup 工作溶液。一般情况下，在 37 ℃ 黑暗条件下孵育 Rosup 30 分钟-4 小时可显著增加 ROS。
【注】：Rosup的孵育时间根据细胞株的敏感性而定，如Hela需30分钟，MRC5需1.5小时。若30分钟内未观察到ROS的上升，可适当增加诱导时间或降低浓度。若ROS上升过快，可适当降低诱导时间或降低浓度。
药物：在含有 10％ FBS 或其他适当溶液的完全培养基中将目标药物制备至所需浓度。
2. 贴壁细胞的推荐实验方案
a) 细胞准备：实验前一天在标准细胞培养基中培养贴壁细胞，使得实验时细胞汇合度达到70％。
b) 药物诱导：除去培养基。将之前制备的无血清稀释药物覆盖在每个孔上，并在 37°C 黑暗条件下孵育所需的时间。
c) (可选) 阳性对照：用之前制备的 Rosup 溶液覆盖阳性对照孔，并在 37°C 黑暗条件下孵育所需时间。
[注]：对于刺激时间较短的细胞（一般在2小时以内），也可以先加载探针，再加入Rosup或目的药物。
d) ROS探针加样：弃去所有培养基，用无血清培养基清洗细胞1-2次，用预先配制的DCFH-DA溶液覆盖每孔，37℃避光孵育30分钟。
e) 弃去培养基并用无血清培养基清洗细胞1-2次，以去除游离的DCFH-DA。
3. 悬浮细胞推荐操作步骤
a) 细胞制备：实验当天，将悬浮细胞培养至每孔约 1.5 × 105 个细胞。
b) 药物诱导：通过离心将细胞收集于锥形管中，并将其重悬于适量先前制备的无血清稀释药物中，并在 37°C 下在黑暗中孵育所需的时间。
c) (可选) 阳性对照：用之前制备的 Rosup 溶液重新悬浮阳性对照细胞，并在 37°C 黑暗条件下孵育所需时间。
d) ROS探针加样：收集细胞，用PBS离心2次，用预先配制的DCFH-DA溶液重悬细胞，细胞密度为1×106-2×107/mL，37℃避光孵育30分钟，每隔3-5分钟翻转一次，确保探针与细胞充分接触。
【注】：细胞密度需根据后续的检测方法进行调整，如流式细胞术时，单管细胞数不应低于104/mL，也不应高于106/mL。
e) 收集细胞并用无血清培养基离心两次洗涤细胞以去除游离的DCFH-DA。
4. 荧光检测与数据分析
荧光显微镜测量：使用荧光显微镜，使用适合荧光素 (FITC) 的滤光片组进行活细胞显微镜检查。目测细胞亮度，比较对照和样品，或使用图像分析方法比较细胞数码照片之间的信号。
流式细胞术测量：应使用胰蛋白酶收集粘附细胞以制备单细胞悬浮液；对于悬浮细胞，直接收集细胞。理想情况下，每个实验条件应分析 10,000 个细胞。实验期间细胞不应过于密集（<1 ×106 个细胞/毫升）。排除碎片并通过门控分离感兴趣的细胞群。使用平均荧光强度，确定对照样品和处理样品之间的倍数变化，Ex/Em = 480/525 nm。
荧光微孔板测量：在培养基存在的情况下，立即在荧光微孔板读数器上以 Ex/Em = 480/525 nm 的终点模式测量微孔板。从所有测量值中减去空白读数，并确定与测定对照的倍数变化。
注意事项
1. 与DCFH-DA孵育后清洗细胞以减少背景噪音。
2. 建议在孵育后尽快测量荧光，以避免可能出现的错误。
3、为了您的安全和健康，操作时请穿着工作服，佩戴一次性手套。
4.仅供研究使用！
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