分子診斷是使用 DNA、RNA 或蛋白質分子作為診斷材料，檢查人體內源基因或外源（病原體）基因的存在、缺陷或異常表達，對人體狀況或疾病進行特定診斷的方法和過程。主要的分子診斷技術包括聚合酶鍊式反應（PCR）、螢光原位雜交（FISH）、基因晶片、基因定序技術等。與雜交、高通量定序技術相比，PCR技術的主要優勢是靈敏度更高、特異性更強、操作簡單、易於推廣。雖然PCR技術在檢測基因數量上有一定的局限性，但短期內其仍將是分子診斷的主流技術。
分子診斷PCR擴增工作流程與原料概述
1.核心酵素材料-Taq DNA聚合酶
隨著應用檢測領域的擴大和市場需求的增加，野生型Taq DNA聚合酶已無法完全滿足要求。
- 優越的穩定性：配製成含有引子和探針的完全預混溶液，經37°C處理7天后，低濃度檢測無變化。
圖1：以HBV核酸為模板，以10726ES製備qPCR完全預混液，除模板外所有成分在37℃下進行7天的加速穩定性檢驗。結果顯示，高、中、低濃度下Ct值和螢光值均無明顯變化，顯示10726ES製備的預混溶液性能穩定。
- 低宿主 gDNA 殘留：每 100 U 中殘留的大腸桿菌基因組 DNA 少於 0.5 個拷貝。
圖2：大腸桿菌基因組DNA的線性範圍：30 fg/μL至300 pg/μL，相關係數R2為0.9999。 （B）三批 Hieff UCF.ME® Sensitive Taq DNA 聚合酶中殘留的大腸桿菌基因組 DNA 每 100 U 少於 0.5 個拷貝。
2、核心酵素原料—逆轉錄酶
逆轉錄酶作為RT-qPCR反應的關鍵組分之一，必須具備更快的逆轉錄速度、更高的合成產量以及更好的耐熱性。為了獲得更適合RT-qPCR的逆轉錄酶，
- 可承受58℃反應溫度，適合複雜RNA模板的逆轉錄
圖3：Hifair® V逆轉錄酶與進口品牌T*逆轉錄酶在55℃和58℃孵育30分鐘，檢測殘留酵素活力。檢測結果顯示，Hifair® V逆轉錄酶在58℃孵育30分鐘後仍能維持70%的活性，大幅超過進口品牌。
- RT-qPCR 檢測率優於其他品牌，檢測範圍為 1 pg 至 1 μg
圖 4：使用濃度範圍從 1 pg 至 1 μg（7 個梯度）的 293T 細胞總 RNA 作為模板，使用 Hifair® V 一步式 RT-gDNA 消化 SuperMix 進行逆轉錄，進行 qPCR（Cat#11142）、V* 和 T*。然後將所得的 cDNA 進行 qPCR 定量分析。結果表明，11142ES靈敏度可達1pg，檢測率優於競爭產品。
3.其他酵素及酵素抑制劑：RNase抑制劑、UDG酶
核糖核酸酶 抑制劑：
尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG酶）：尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG酶）與dUTP合併使用可以建立PCR污染預防系統。逸生的耐熱低UDG酶可避免常規UDG酶失活後殘留活性，造成含dU的擴增產物在室溫下降解。它還可以防止因分子酶中存在的背景細菌而導致 PCR 結果出現假陽性。這對於準確識別傳染性病原體、協助感染和傳染病的臨床診斷至關重要。
Taq DNA聚合酶抗體：非特異性擴增是顯著影響PCR性能的主要問題之一，熱啟動技術可有效減少非特異性擴增。抗體修飾的熱啟動酶封閉效率高、性能優良，常溫下穩定，酵素活性釋放速度快。逸生生物研發的雙抗體熱啟動Taq酶不僅封閉了Taq酶的5'→3'聚合酶活性，也同時封閉了5'→3'外切酶活性。這種雙重方式既有效地防止了由於錯配或引子二聚體引起的非特異性擴增，又防止了由於探針或引子的降解而產生非特異性訊號，從而雙重提高了試劑的穩定性。
4.通用高性能單管qPCR Master Mix
- 通用性好：適用於多種類型的多種引子和探針（已驗證40餘種不同類型的標靶），具有優異的擴增性能；
- 公升 超全預混料穩定性： 37℃保存14天，4℃保存28天，反覆凍融50次；
- 靈敏度高、特異性佳： 靈敏度可檢測出0.25拷貝/μL，特異性48孔無負峰；
- 支援快程序：相容快速程序，30min即可出結果；
- dUP/UDG防污染系統： 引入dUTP/UDG防污染系統，有效防止氣溶膠污染；
- 多平台、多系統應用： Bio-Rad CFX96、ABI Q5、7500、Slan、天龍等
圖 5：基於一體式預混試劑的穩定性研究，16710ES 以三種不同的方式處理（4°C、37°C 和凍融循環）。實驗組分別在4℃和37℃下處理7天，並進行50次凍融循環，對照組（-20℃保存）在4種多重擴增體系下進行穩定性評估（組1、2、4為四重擴增體系，組3為三重擴增體系）。結果顯示實驗組與對照組Ct值（ΔCt）偏差在±0.5以內，螢光值偏差在15%以內，證明
5.通用高性能RT-qPCR預混液
一步法 RT-qPCR 試劑整合了逆轉錄酶和熱啟動酶的卓越性能，並輔以優化的緩衝系統，能夠快速靈敏地檢測個位數拷貝模板。這些試劑經過呼吸道疾病、動物疫情、研究系統等多個客戶市場的驗證，可滿足各個應用方向的需求。
- 通用性好：適用於病原微生物、人類基因組、植物等物種的核酸qPCR擴增與檢測；
- 高靈敏度：精心優化的緩衝體系，將低濃度模板的檢測靈敏度提高至250拷貝/mL；
- dUP/UDG 防污染系統：引進dUTP/不耐熱UDG防污染體系，高效率降解產品氣溶膠污染，降低假陽性，保證結果真實；
- 支援快程序： 相容快速程序，40min即可出結果；
- 超強穩定性： 37℃保存14天，反覆凍融10次。
檢測靈敏度評估
圖 6：利用
產品推薦
| 產品類型 | 產品名稱 | 貨號 |
| PCR酶系列 | Hieff UNICON® Hotstart E-Taq DNA 聚合酶，5 U/μL | 10726ES |
| Hifair® V 逆轉錄酶(200 U/μL) | 11300ES | |
| 尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG / UNG），熱不穩定，1 U / μL | 10303ES | |
| 小鼠 RNase 抑制劑 (40 U/µL) | 10603ES | |
| dNTP 混合物（各 25 mM） | 10125ES | |
| 超低宿主殘留超潔淨PCR單酶系列 | Hieff UCF.ME® 熱啟動敏感 Taq DNA 聚合酶 (5 U/μL) | 14314ES |
| Hifair UCF.ME® V 反轉錄酶 (200 U/μL) | 14608ES | |
| UCF.ME® 尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (UDG/UNG)，熱不穩定，1 U/μL | 14466ES | |
| 佛羅裡達大學。ME® 鼠 RNase 抑制劑（40 U/µL） | 14672ES | |
| Lyo-Ready PCR單酵素系列 | Hieff UNICON® HotStart E-Taq DNA 聚合酶，不含甘油（5U/μL） | 14316ES |
| Hifair® V 逆轉錄酶，不含甘油（600 U/μL） | 11301ES | |
| 尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG），熱不穩定（1 U/μL，不含甘油） | 10707ES | |
| 小鼠RNase抑制劑（200 U/µL，無甘油） | 10703ES | |
| RT-qPCR 預混液 | Hifair® C203P1 多重一步法 RT-qPCR 探針試劑盒（UDG Plus） | 16630ES |
| Hifair® V 多重一步法 RT-qPCR 探針試劑盒（UDG Plus） | 11899ES | |
| Hifair® Lyo Multiplex 一步式 RT-qPCR 試劑盒 | 11831ES | |
| qPCR 預混液 | Hieff Unicon® Universal TaqMan Pro U+ qPCR Mix（單管） | 16710ES |
| Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix（UDG plus） | 13891ES | |
| Hieff Unicon® Superpro Ⅰ TaqMan qPCR Master Mix（UDG plus） | 11827ES | |
| Hieff Unicon® Purepro Ⅰ TaqMan qPCR Master Mix（UDG plus） | 11853ES | |
| Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix（UDG plus） | 11893ES |