隨著幹細胞治療和基於類器官的藥物開發的進步，基底膜基質作為乾細胞培養和類器官、3D 細胞培養以及其他應用（包括血管生成、體內腫瘤發生實驗等）的營養和支持載體發揮關鍵作用。在室溫下，Ceturegel™基底膜基質聚合形成具有生物活性的三維基質。它能夠在體內模擬細胞基底膜的結構、組成、物理性質和功能，有利於細胞的體外培養和分化，是一種很好的基質膠替代品。

1. Ceturegel™基底膜基質是什麼？
2. Ceturegel™基底膜基質的作用是什麼？
3. Ceturegel™基底膜基質的特性是什麼？
4. Ceturegel™基底膜基質的廣泛應用
5. 常見問題
6. Ceturegel™基底膜基質的選擇指南 Yeasen

1. Ceturegel™基底膜基質是什麼？

內皮細胞、上皮細胞、肌肉和神經元細胞鄰近的基質形成連續的、分層的細胞外基質，稱為基底膜。基底膜在發育和傷口癒合過程中會退化和再生。它不僅支持細胞和細胞層，而且透過影響細胞黏附、遷移、增殖和分化（基底膜的功能）在組織形成中發揮重要作用。因此可以說基底膜是轉移性腫瘤細胞侵襲的主要屏障。

圖 1. Ceturegel™ 基底膜基質

Ceturegel™ 基底膜基質由 Yeasen 不含LDEV（乳酸脫氫酶增強病毒），內毒素含量超低。並經過支原體檢測，確保無支原體污染，包括基礎濃度、高濃度、低生長因​​子等不同種類。

2. Ceturegel™基底膜基質的作用是什麼？

Ceturegel™基底膜基質可用於製備各種需求的基底膜基質。可用於細胞訊號傳導研究，如生長因子在小鼠腎幹細胞形成腎小管的作用研究、小鼠乳腺上皮幹細胞的基因表現研究、Transwell的腫瘤侵襲性實驗等。同時可用於細胞形態、生化功能、遷移、感染、基因表現等的研究。 Ceturegel™基底膜基質可以有效幫助上皮細胞和其他類型細胞的附著和分化，包括神經細胞、幹細胞、哺乳動物上皮細胞、黑色素瘤細胞、血管內皮細胞、甲狀腺細胞和毛囊細胞。同時，Ceturegel™基底膜基質也影響小鼠乳腺上皮細胞的蛋白質表現水平，並支持週邊神經再生。

圖 2.Ceturegel™基底膜基質的主要應用方向

細胞遷移與侵襲詳解：細胞遷移又稱細胞爬行、移動或移動，是指細胞接收到遷移訊號或感受到某種物質的梯度後所進行的移動行為。細胞遷移是細胞頭部偽足伸出、細胞體尾部縮回的交替過程。細胞遷移是正常細胞的基本功能之一，也是身體正常生長發育的生理過程。作為活細胞中普遍存在的運動形式，它能夠參與多種集體的生理和病理過程。如胚胎發育、血管生成、傷口癒合、免疫反應、發炎反應、動脈粥狀硬化、癌症轉移等。細胞侵襲是正常細胞和癌細胞對化學和機械刺激的反應。細胞侵襲常發生在傷口修復、血管生成、發炎、腫瘤細胞轉移、組織異常浸潤等過程。

3. Ceturegel™基底膜基質的特性是什麼？

安全性高：無LDEV（乳酸脫氫酶增加病毒）
濃度多樣性：濃度範圍在8~20mg/ml之間
良好的批次穩定性：嚴格的生產質檢流程，確保批間性能穩定
低內毒素：內毒素含量<8 EU/ml
污染檢測：未檢測到支原體、細菌和真菌殘留
單批產量高：單批次產量在50L以上
相容性：與任何類型的細胞培養基相容

4. Ceturegel™基底膜基質的廣泛應用

4.1 遷移和侵襲試驗

檢測細胞遷移和侵襲能力的實驗方法是Transwell實驗，Transwell又稱為穿孔實驗。由於腔室具有密集的孔隙，因此首先將細胞懸浮液添加到腔室中。然後將這些腔室放入24孔板中，並在其中添加完全培養基。細胞變形，並透過腔室中的孔洞到達營養更豐富的腔室外部，並黏附在外部。透過對腔外細胞進行染色和計數，可以判斷細胞的遷移和侵襲能力。 Transwell的原理是，在培養板裡面放上小室，小室叫上室，培養板叫下室。用聚碳酸酯膜將上下層培養液隔開，將上層培養液加入上室，下層培養液加入下室。細胞在上室，由於膜的通透性，下層培養基的成分會影響上室的細胞。此外，也研究了下層培養基成分對細胞生長和運動的影響。
Ceturegel™基底膜基質在遷移和侵襲實驗中的具體操作：將稀釋的Ceturegel™基底膜基質加入到Transwell上室，將細胞接種在37°C、5% CO₂ 孵箱培養24小時，4％多聚甲醛固定，0.1％結晶紫染色液染色。在倒置相差顯微鏡下觀察並計數細胞。

圖3 細胞侵襲後結晶紫染色結果

4.2 血管生成

1）實驗前一天，取出Ceturegel™ 從冰箱中取出 Matrigel 並將其放置在 4°C 冰箱中過夜以解凍，同時預冷所使用的耗材。
2) 實驗前請務必將 Ceturegel™ Matrigel 放在冰盒中。打開血管生成玻片的無菌包裝並取出玻片。
3) 每個孔加入10 μl Ceturegel™ Matrigel。注意添加 Ceturegel™ Matrigel 時槍頭應垂直於內孔上方，防止 Matrigel 流過上孔留下膠水殘留。
4）先蓋上載玻片，準備10cm的培養皿，放上浸過水的紙巾，做成濕盒。
5) 將玻片放入培養皿並蓋上培養皿。將其放入 CO₂ 培養箱中，靜置30分鐘左右，待凝膠凝固，同時製備細胞懸浮液。
6) 將消化後的細胞製成密度為2*10⁵ 細胞/毫升並充分混合。
7) 取出含有已凝固成凝膠的血管的玻璃玻片。在每個孔中加入 50 μl 細胞懸浮液，注意保持移液器尖頭垂直於上孔上方，不要接觸下孔中的凝膠。
8) 加入細胞培養基，蓋上蓋子，靜置。一段時間後，所有細胞都會沉到 Matrigel 的表面。

圖4.血管新生結果圖

免疫螢光染色

1）小心地從孔中取出培養基，不要接觸膠水或細胞網絡。將鈣黃綠素在無血清培養基中稀釋至最終濃度為 6-8 µg/ml。加入細胞染色液，完全浸沒細胞，室溫避光孵育30-40分鐘。
2)用 PBS 洗滌三次。請注意，應緩慢將 PBS 加入上部孔中以避免影響細胞。使用 Ex=485 nm、Em=529 nm 波長進行螢光觀察

圖5. 血管免疫螢光染色

4.3 3D 細胞培養

與傳統細胞培養不同，3D 細胞培養再現了細胞的體內環境。即使是簡單的球體模型也可以彌補單層培養的缺點。這些結構可以形成氧氣、營養物質、代謝物和可溶訊號的梯度，進而形成多樣化的細胞群。 3D細胞培養技術可以更好地模擬細胞在生物體內生存的自然環境，使得細胞之間的相互作用以及生化和生理反應更加真實。在 3D 環境中，細胞對內源性和外源性刺激的反應更接近其體內反應。
Ceturegel™基底膜基質在3D細胞培養中的具體操作為：將Ceturegel™基底膜基質與調整濃度的單細胞HepG2懸浮液1：1輕輕混合，用預冷的槍頭將50μl上述混合後的單細胞懸浮液加入預冷的24孔板中，形成拱形細胞滴，放入37℃上述混合後的單細胞懸浮液加入預冷的24孔板中，形成拱形細胞滴，放入37℃、5CO2培養箱中，每天觀察。

圖 6. 3D 細胞培養結果

表1. 3D細胞培養Ceturegel™基底膜基質使用參考：

註：不同批次的Ceturegel™基底膜基質有一定的濃度差異，建議用量僅供參考

4.4 體內成瘤實驗

以HepG2細胞裸鼠皮下成瘤實驗為例，以Ceturegel™基底膜基質與細胞懸浮液1:1稀釋，接種於4-5週齡BALB/c-nu雌性小鼠皮下。實驗過程如下：
♦ 準備對數生長、細胞密度約80-90%的HepG2細胞，收集細胞前一天晚上換新鮮培養基。
♦ 細胞被胰蛋白酶消化。當細胞變圓不離開培養皿時，除去胰酶，加入無血清培養基製成細胞懸浮液，離心清洗一次，終濃度為5×10⁷ 細胞/毫升
♦ 在 4 ℃ 下將細胞懸浮液和 Ceturegel™ 基底膜基質以 1:1 的比例稀釋，使其最終濃度為 5 × 10⁷ 細胞/毫升
♦ 用左手抓住固定的裸鼠，在裸鼠右肩進行皮下注射。接種時，針頭插入皮下稍深，約1cm深，以減少注射後細胞懸浮液從針眼溢出。
接種量為200μL。
♦ 將裸鼠放回籠中繼續餵養，約1週至1個月即可見到腫瘤。根據實驗設計,當腫瘤體積達到要求時對裸鼠實施安樂死,並拍照。

註：對照組為培養基與細胞的懸浮液，最終密度與基質膠測試組相同。

4.5 類器官培養

類器官是由幹細胞分化而來的三維多細胞微小組織。有些器官的特性是可以複製的。類器官是多細胞的，具有高度的自組裝性，因此比傳統的二維培養物更能表現出複雜的體內細胞反應和相互作用。來自正常或患病組織的幹細胞和/或器官祖細胞可以與 Ceturegel™ 基底膜基質或膠原蛋白混合。形成腎臟、甲狀腺、肝臟、腦、肺、腸、攝護腺等微器官。例如，對於進行基因篩選的研究人員來說，Ceturegel™ 基底膜基質基底可用作生物墨水，從而實現 3D 生物列印中活細胞/類器官的精確定位和嵌入。

圖7. 類器官操作流程

小鼠小腸類器官構建

樣本準備：小鼠斷頸處死，表面噴灑酒精消毒。無菌環境下切取距胃端近3~15cm的腸組織，用鑷子小心去除腸道外面的腸系膜及脂肪，放入4℃預冷的含有1%雙抗的DPBS溶液中。

樣本清洗：用注射器沖洗腸道2-3次，用手術剪將腸道小心剪開，腸腔朝上，用手術刀片輕輕刮掉腸腔表面的腸絨毛，待腸絨毛刮掉後（露出透明組織），將腸組織放入新的含有DPBS的培養皿中，重複2-3次。

樣本初步處理：將洗淨的小腸組織切成2mm寬的小塊，轉移至新的50ml離心管中。用DPBS輕輕清洗3-5次，以去除腸絨毛細胞和漂浮的脂肪組織。

樣本消化：將清洗乾淨的小腸碎片加入10-15ml預冷的含有3-5mM EDTA的DPBS消化，4℃孵育約30min，其間每隔10min輕輕振搖離心管一次。

消化後，棄去EDTA消化液的上清液，用新的DPBS緩衝液輕輕沖洗組織2-3次，以去除剩餘的EDTA。

將10-15ml預冷的含有0.1％BSA的DPBS加入小腸組織碎片中，重複吹打、重懸組織碎片，使凹陷處與基底層分離，取少許懸浮液進行顯微鏡檢查。當看到大量凹陷狀結構時，停止吹氣，將吹出的組織懸浮液以70%μM濾網過濾收集通過濾網的組織懸浮液。

重複步驟5-6兩次，1500rpm、4℃離心3min。

混合物的配製：Ceturegel™基質膠懸浮液凹陷組織沉澱，每10μL基質膠懸浮液含有200~600個凹陷。重新懸浮後，將混合物放在冰上並儘快操作，以避免基質膠形成凝膠。
註：基質膠的稀釋比例≥50%，以確保Ceturegel™在培養過程中基質黏合結構的穩定性。

將混合好的懸浮液點於24孔板底部中央，左右每孔各30~50μL，避免懸浮液接觸孔板側壁。

將培養好的培養板放入37℃二氧化碳恆溫培養箱中，培養約30min，直到基質凝膠凝固。

等待Ceturegel™基質膠完全凝固後，沿著牆壁緩慢加入配製的腸道器官培養基，每孔800μL。

將24孔板放入37℃二氧化碳培養箱中培養。每3天更換一次新鮮培養基，並監測器官等的生長狀況。一般小鼠小腸類器官在5-7天內形成。

圖8 小鼠小腸樣器官體外培養結果

5. 常見問題

1.所得基材顏色有差異（淡黃色至深紅色）是什麼原因？
對於含有酚紅的Ceturegel™基底膜基質，主要是由於酚紅與碳酸氫鹽與CO相互作用所引起的₂但用5% CO平衡後色差會降低₂。冷凍和解凍後，輕輕搖晃小瓶以使 Ceturegel™ 基底膜基質均勻分散。
2. Ceturegel™基底膜基質操作時應注意哪些事項？
所有操作應在無菌環境中進行，並使用預冷的移液器以確保 Ceturegel™ 基底膜基質均質化。
3. 如何冷凍保存Ceturegel™基底膜基質以供使用？
冷凍和解凍後的 Ceturegel™ Matrix LDEV-Free Ceturegel™ 基底膜基質可以分佈在多個小管中。所有分配都應放在預冷的冷凍管中，並應快速冷凍和儲存，以避免多次冷凍和解凍。所有相關物品在使用前都應預冷。使用預冷的移液器、吸頭和小管來處理 Ceturegel™ 基底膜基質。

6. Ceturegel™基底膜基質的選擇指南 Yeasen

不同類型的 Ceturegel™ 基底膜基質有不同的應用。標準濃度的 Ceturegel™ 基底膜基質可用於極性細胞培養，例如上皮細胞。可促進多種細胞分化，用於腫瘤細胞遷移、侵襲實驗。高濃度的Ceturegel™基底膜基質在體內被廣泛使用，可用於小管形成實驗。低生長因子（GFR）主要作用是消除實驗中生長因子的干擾​​，適用於基底膜製備要求較高的研究。 Ceturegel™基底膜基質不含酚紅，可消除酚紅指示劑的干擾，適用於比色、螢光檢測等顯色實驗。人類胚胎幹細胞培養級Ceturegel™基底膜基質專門用於人類胚胎幹細胞培養、誘導多能無飼養層幹細胞培養。 Yeasen 提供多種類型的Ceturegel™基底膜基質，您可以根據您的實驗進行選擇。

表 2. Ceturegel™基質選擇指南

產品類型	貨號	產品名稱	Matrigel 貨號	申請方向
基礎濃度（8-12 mg/ml）	40183ES	Ceturegel™Matrix LDEV-Free	356234/ 354234	適應二維和三維培養、侵襲、遷移實驗，也可用於體內致瘤實驗
	40184ES	Ceturegel™Matrix不含酚紅，不含LDEV	356237	主要用於螢光檢測實驗等顏色檢測
生長因子減少	40185ES	Ceturegel™Matrix GFR，LDEV-Free	354230	主要是為了排除生長因子對實驗的干擾。應用於生長因子、訊息傳遞路徑等相關研究。
	40186ES	Ceturegel™Matrix GFR，不含酚紅，不含LDEV	356231
高濃度（≥18mg/ml）	40187ES	Ceturegel™基質高濃度，不含LDEV	354248	主要用於血管生成、凝膠栓塞、體內腫瘤形成等實驗（對於血管生成，建議Ceturegel™基底膜基質的終濃度≥10mg/ml）
	40189ES （詢問）	Ceturegel™Matrix高濃度，GFR，無LDEV	354263
	40188ES	Ceturegel™Matrix 高濃度，不含酚紅，不含LDEV	354262
對於幹細胞	40190ES	Ceturegel™Matrix 符合 hESC 標準，不含 LDEV	354277	主要用於幹細胞培養，如hESC、iPSC等。
類器官特異性	40191ES （詢問）	Ceturegel™類器官培養基質，不含酚紅，不含LDEV	356255	用於類器官培養的 Ceturegel™ 基底膜基質