أصدقائي الأعزاء، هل تشعرون بالحيرة عند مواجهة أجسام مضادة مختلفة للتحكم في التحميل ووضع العلامات على النمط الوراثي أثناء عملية التنقيب عن البروتين؟ يتم ترميز البروتينات بواسطة جينات التدبير المنزلي في الكائنات الحية ويتم التعبير عنها بشكل ثابت في أنسجة متعددة. يتم استخدامها للتحقق مما إذا كانت التجارب المناعية تسير بشكل طبيعي وكمعيار شبه كمي للكشف عن التعبير عن البروتين. إذن، كيف تختار الأجسام المضادة للتحكم في التحميل بشكل صحيح؟ يمكنك الرجوع إلى النقاط التالية.
أولا: أصل الأنواع العينة
- بالنسبة للعينات من الأنسجة أو الخلايا الثديية، يتم اختيار β-actin، α-tubulin، GAPDH، Lamin-B، Histone H3، Na+/K+-ATPase بشكل عام.
- بالنسبة للعينات المشتقة من النباتات، اختر بشكل عام الأكتين النباتي، أو الروبيسكو، وما إلى ذلك.
- بالنسبة للعينات الأخرى التي تتطلب بحثًا أقل، اختر البروتين المناسب كمرجع داخلي من خلال استشارة الأدبيات أو قواعد البيانات ذات الصلة.
تأكد من أن الوزن الجزيئي للبروتين المستهدف يختلف عن الوزن الجزيئي لبروتين التحكم في التحميل بأكثر من 5 كيلو دالتون لمنع التداخل أثناء الكشف. على سبيل المثال، إذا كان البروتين المستهدف 40 كيلو دالتون، فليس من المناسب اختيار بيتا أكتين (42 كيلو دالتون) كعنصر تحكم في التحميل. فكر في استخدام GAPDH (36 كيلو دالتون) أو بيتا توبيولين (55 كيلو دالتون) كعنصر تحكم في التحميل.
ثالثًا: موقع التعبير عن البروتين المرجعي الداخلي
ملحوظة: تجنب المواقف التالية عند استخدام تحميل الأجسام المضادة للتحكم
| التوطين تحت الخلوي | التحكم في تحميل البروتين | الوزن الجزيئي (كيلو دالتون) | ملحوظات |
| السيتوبلازم، الخلية الكاملة | بيتا أكتين | 42 | غير مناسب للمستخلصات النووية. بيتا أكتين هو أحد مكونات مجمعات إعادة تشكيل الكروماتين؛ قد لا يكون مناسبًا للمواقف التي توجد فيها اختلافات كبيرة في العمر بين الأشخاص الذين يتم البحث عنهم. |
| ألفا توبيولين | 55 | لا يصلح في الحالات التي توجد فيها فروق كبيرة في الأعمار بين المشاركين في البحث. يتغير تعبير التوبيولين مع الأدوية المضادة للميكروبات والمضادة للانقسام، لذا فهو غير مناسب عند إضافة الأدوية المضادة للسرطان والمضادة للفطريات. | |
| بيتا توبيولين | 55 | ||
| جابده | 36 | سيؤدي نقص الأكسجين في الخلايا إلى زيادة التعبير عن GAPDH، لذا فهو غير مناسب للدراسات المتعلقة بالأكسجين. يمكن أن تؤدي عوامل مثل مرض السكري إلى زيادة التعبير عن GAPDH. | |
| فينكولين | 117 | يمكن الإشارة إليها للبروتينات ذات الوزن الجزيئي الكبير. | |
| الميتوكوندريا | سلسلة كوكسيف | 15-17 | تتركز هذه السلسلة من البروتينات بشكل أساسي عند 15-17 كيلو دالتون. إذا كان الوزن الجزيئي للبروتين المستهدف قريبًا، ففكر في أجسام مضادة أخرى للتحكم في التحميل. |
| إتش إس بي 60 | 60 |
| |
| نواة | في دي ايه سي 1/2 | 31-37 | تتركز هذه السلسلة من البروتينات بشكل أساسي عند 31-37 كيلو دالتون. |
| لامين ب1 | 66 | غير مناسب للخلايا الجذعية الجنينية، وغير مناسب للتحكم في التحميل في تجارب موت الخلايا المبرمج. | |
| تحليل البيانات الشخصية | 36 | غير مناسب للخلايا غير المتكاثرة. | |
| تي بي بي | 33-43 | تبلغ قيمة TBP ما بين 37-43 كيلو دالتون عند البشر و33-36 كيلو دالتون عند الفئران والجرذان، وهي غير مناسبة لتجارب موت الخلايا المبرمج. | |
| سنة1 | 65-70 |
| |
| هيستون H3 | 17 | يبلغ الوزن الجزيئي لمعظم البروتينات حوالي 17 كيلو دالتون. إذا كان الوزن الجزيئي للبروتين المستهدف قريبًا، ففكر في أجسام مضادة أخرى للتحكم في الحمل. | |
| الدم الكامل، المصل، البلازما | الترانسفيرين | 77 | يتأثر التعبير ببعض الحالات المرضية والعلاجات، مثل حمض الريتينويك. |
| الزلال | 66 | المحتوى مرتفع للغاية، انتبه إلى تقليل تحميل العينة في تجارب WB. |
تعمل الأجسام المضادة بشكل أفضل عند استخدامها معًا
في التجارب التي تدرس تفاعلات البروتين، مثل السحب للأسفل، يمكن دمج علامات النمط الظاهري مع الطرف N أو C للبروتين المستهدف من خلال الطرق البيولوجية الجزيئية. تشمل علامات النمط الظاهري المستخدمة بشكل شائع His وHA وMyc وGST. لا تؤثر علامات النمط الظاهري هذه عادةً على النشاط البيولوجي والتوطين داخل الخلايا للبروتين المستهدف. لقد وفر ظهور علامات النمط الظاهري الراحة للبحث العلمي والإنتاج الصناعي.
| علامة النمط الظاهري | تسلسل العلامات | الوزن الجزيئي (كيلو دالتون) |
| علامة HA | يبيدفيديا | 1.1 |
| علامة مايك | إكليسايدل | 1.2 |
| علامة العلم | هل فهمت؟ | 1 |
| علامة ضريبة السلع والخدمات | - | 26 |
| علامة GFP | - | 26.9 |
| علامة V5 | GKPIPNPLLGLDST | 1.4 |
| علامة S | كيتااكفيركمدس | 1.8 |
| العلامة الإلكترونية | الفجوة | 1.4 |
معلومات المنتج
| يكتب | اسم المنتج | الوزن الجزيئي (كيلو دالتون) | رقم المنتج |
| تحميل الأجسام المضادة للتحكم | β-actin، الأجسام المضادة وحيدة النسيلة للفأر | 42 | 30101ES |
| β-أكتين، pAb الأرنب | 42 | 30102ES | |
| GAPDH (نسخة طبق الأصل: 1A6)، جسم مضاد وحيد النسيلة للفأر | 36 | 30201ES | |
| GAPDH، pAb الأرنب | 36 | 30202ES | |
| ألفا توبيولين، الأجسام المضادة وحيدة النسيلة للفأر | 50-55 | 30304ES | |
| β-Tubulin، الأجسام المضادة وحيدة النسيلة للفأر | 50-55 | 30301ES | |
| β-Tubulin، pAb الأرنب | 50-55 | 30302ES |