1. ما هي الخلايا الشجيرية (DC)؟
الخلايا الشجيرية هي الخلايا المقدمة للمستضدات الأكثر فعالية في جسم الإنسان. الخلايا الشجيرية هي الخلايا المقدمة للمستضدات الوحيدة القادرة على تحفيز تكاثر الخلايا التائية الساذجة بقوة. لا تستطيع الأنواع الأخرى من الخلايا المقدمة للمستضدات (مثل الخلايا الوحيدة والبلعميات والخلايا البائية وما إلى ذلك) تحفيز الخلايا التائية النشطة أو الذاكرة إلا. لذلك، تعد الخلايا الشجيرية هي البادئة لاستجابات المناعة الخلوية التائية التكيفية وتلعب دورًا مهمًا للغاية في مناعة الورم. تعبر الخلايا الشجيرية بشكل كبير عن جزيئات MHC-I وMHC-II على سطحها ولديها علامات سطحية محددة. تستقبل الخلايا التائية وتعالجها وتحفزها لتنشيط المستضدات، وتحدد في النهاية اتجاه تمايز الخلايا التائية.
2. مصدر التيار المستمر
توجد الخلايا التغصنية بكميات صغيرة جدًا في الجسم. يستغرق عزل الخلايا التغصنية مباشرة من الجسم وقتًا طويلاً ويكون العائد من الخلايا منخفضًا جدًا، مما يحد بشكل كبير من الأبحاث وتطبيق الخلايا التغصنية. ومع ذلك، يمكن تمييز الخلايا التغصنية وتحفيزها من الخلايا السلفية للخلايا التغصنية في أنسجة مختلفة، مثل الخلايا السلفية في سائل نخاع العظم، والخلايا الوحيدة في الدم المحيطي ودم الحبل السري.
بالنسبة للبشر، نظرًا لأن الدم المحيطي البشري هو الأكثر ملاءمة للحصول عليه ويحتوي على أكبر عدد من الخلايا الوحيدة، فإن الطريقة الأكثر شيوعًا هي تحريض الخلايا الشجرية من الخلايا الأحادية النواة في الدم المحيطي البشري (PBMC). بالنسبة للفئران، فإن الطريقة الأكثر شيوعًا هي تحريض الخلايا الشجرية من خلايا نخاع العظم، أي الخلايا الشجيرية المشتقة من نخاع العظم (BMDC).
الشكل 1. مخطط تخطيطي لطريقة تحضير BMDC الكلاسيكية
3. طريقة تحضير BMDC
الطرق الشائعة لإعداد خلايا نخاع العظم للفئران هي:
3.1 طريقة زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم الكلاسيكية - طريقة إينابا (معدلة)
3.2 تحضير واسع النطاق لـ BMDC - طريقة Sons
3.3 تحضير واسع النطاق لـ BMDC - طريقة لوتز
3.1 [طريقة زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم الكلاسيكية] - طريقة إينابا (المحسنة)
【خلفية】
أ. عدد الخلايا الجذعية المكونة للدم التي تم الحصول عليها بطريقة إينابا هو 5-7 × 106/الفأرة؛
ب. تستخدم طريقة إينابا الأصلية فقط GM-CSF لتحفيز إنتاج الخلايا BMDC. وعلى الرغم من أن الخلايا BMDC التي تم الحصول عليها تتمتع بقدرة تحفيز قوية في تفاعل الخلايا الليمفاوية المختلطة، فإن نضج الخلايا التغصنية ليس جيدًا مثل التحفيز المشترك لـ GM-CSF + IL-4. لذلك، غالبًا ما تستخدم الطريقة المحسنة اللاحقة التحفيز المشترك لـ GM-CSF + IL-4.
【خطوات الزراعة】
3.1.1 الحصول على خلايا نخاع العظم من الفأر
1) تم قتل الفئران (من عمر 6 إلى 10 أسابيع) عن طريق خلع عنق الرحم، وتم إزالة جميع عظام الفخذ والساق جراحيًا، وتم إزالة الأنسجة العضلية حول العظام قدر الإمكان بالمقص والملقط.
[ملحوظة] لا تضر العظام.
2) انقلي العظم إلى طاولة نظيفة وانقعيه في طبق ثقافة معقم يحتوي على 70% كحول لمدة 2-5 دقائق للتطهير والتعقيم، ثم اغسليه مرتين باستخدام PBS المعقم.
3) انقل العظم إلى طبق زراعة جديد آخر يحتوي على PBS، ثم اقطع طرفي العظم بالمقص، ثم استخدم حقنة لاستخراج PBS. أدخل الإبرة في تجويف نخاع العظم من طرفي العظم، واغسل نخاع العظم بشكل متكرر في طبق الزراعة حتى يتحول لون العظم إلى الأبيض تمامًا.
4) قم بتجميع معلق نخاع العظم وقم بتصفية الأجزاء الصغيرة والأنسجة العضلية باستخدام شبكة من النايلون مقاس 200 شبكة.
5) قم بطرد السائل المرشح عند درجة حرارة 1200 دورة في الدقيقة ل 5 دقائق وتخلص من السائل العلوي.
6) أضف 2 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء كلوريد الأمونيوم (1x)، وأعد تعليق الخلايا، واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقائق، ما يصل إلى 10 دقيقة.
7) أضف 10 مل من PBS لتحييد تأثير محلول التحلل، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 1200 دورة في الدقيقة لـ 5 دقائق وتخلص من السائل العلوي.
8) اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS، ثم أعد تعليق الخلايا في وسط زراعة RPMI1640 الذي يحتوي على 10% من FBS. تم الحصول على خلايا نخاع العظم من الفئران.
تحضير محلول تحلل خلايا الدم الحمراء باستخدام كلوريد الأمونيوم:
أ. قم بإعداد 10x محلول تخزين على النحو التالي: الوزن 82.9 غرام NH4Cl، 10.0 جم KHCO33 و 0.37 جرام من الصوديوم2EDTA، يذوب في 1 لتر من الماء المقطر، ثم يصفى مع 0.22 غشاء فلتر ميكرومتر للتعقيم والتخزين عند 4 درجات مئوية لمدة 6 أشهر؛
ب. قبل الاستخدام، قم بتخفيف محلول التخزين 10x بالماء المقطر المعقم بنسبة 1:9 إلى 1x محلول العمل.
[ملحوظة] نظرًا لأن محلول تحلل خلايا الدم الحمراء كلوريد الأمونيوم له تأثير ضار معين على خلايا نخاع العظم، فيجب تقصير وقت تحلل الدم قدر الإمكان.
3.1.2 تحريض تمايز الخلايا BMDC
1) قم بعد خلايا نخاع العظم للفأر التي تم الحصول عليها في الخطوة 1 واضبط تركيز الخلايا على 0.5-1× 106/مل مع وسط الثقافة الكاملة RPMI 1640 يحتوي على 10٪ من FBS.
2) ضع في طبق ثقافة مكون من 24 بئرًا، 1 مل من الخلايا لكل بئر، وأضف GM-CSF للفأر المعاد تركيبه (20 نانوغرام/مل) وIL-4 (10 نانوغرام/مل)، والثقافة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 الحاضنة. هذا هو اليوم رقم 0 للثقافة.
【ملحوظة】
أ. بشكل عام، حوالي 4-5x107 يمكن حصاد خلايا نخاع العظم من فأر واحد، وبالتالي يمكن حصاد ما لا يقل عن 40-50 بئرًا من صفيحة مكونة من 24 بئرًا.
ب. تتراوح تركيزات GM-CSF وIL-4 بين 20 و50 نانوغرام/مل و 10-40 نانوغرام/مل، على التوالى.
3) رجّي طبق الثقافة بلطف كل يومين، ثم استبدلي 3/4 الحجم بوسط ثقافة جديد وقومي بتجديد السيتوكينات.
4) بين اليوم الخامس والثامن، قم بنفخ وسط الثقافة بلطف لجمع الخلايا المعلقة والخلايا المرتبطة بشكل فضفاض.
5) الطرد المركزي على درجة حرارة 1200 دورة في الدقيقة ل 5 دقائق وتخلص من السائل العلوي.
6) أعد تعليق الخلايا في وسط الثقافة الكامل RPMI 1640 الذي يحتوي على 10% من FBS وعدها، ثم اضبط تركيز الخلايا إلى 1×106/مل، وأضف GM-CSF الفأري المعاد تركيبه (20 نانوغرام/مل) وIL-4 (10 نانوغرام/مل).
7 ) ضع الخلايا في أطباق ثقافة بقطر 100 مم (حتى 10 مل لكل طبق) أو أطباق ثقافة ذات 6 آبار (2 م/بئر).
8) استمر في الزراعة في درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون2 حاضنة لمدة 1-2 يوم.
9) قم بجمع الخلايا المعلقة، والتي تعتبر خلايا نخاع العظم الأكثر نضجًا.
【ملحوظة】
أ. الخطوات 2.5-2.8 هي خطوات إعادة الطلاء، والغرض منها هو جعل BMDC التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.4 أكثر نضجًا.
ب. في غضون 3 ساعات بعد إعادة الطلاء، يمكن رؤية العديد من الخلايا الشائكة الملتصقة المهاجرة من مجموعات الخلايا التغصنية، وبعد يوم واحد من الثقافة، سيتم العثور على هذه الخلايا الملتصقة منفصلة عن الجزء السفلي من لوحة الثقافة، ويمكن رؤية العديد من الخلايا التغصنية النموذجية تطفو في وسط الثقافة.
3.1.3 النضج الكامل لـ BMDC
[ملاحظة] إن الخلايا الجذعية المكونة للدم التي تم الحصول عليها في الخطوة 2 ليست خلايا شجيرية ناضجة تمامًا. إذا كنت ترغب في الحصول على خلايا شجيرية ناضجة تمامًا، فلا يزال يتعين عليك التحريض بواسطة LPS أو CD40L أو TNF-a.
1) قم بطرد BMDC الذي تم الحصول عليه في الخطوة 2.4 أو 2.9 عند 1200 دورة في الدقيقة ل 5 دقائق وتخلص من السائل العلوي.
2) أعد تعليق الراسب باستخدام وسط الثقافة الكامل RPMI الذي يحتوي على GM-CSF الفأري المعاد تركيبه (20 نانوغرام/مل) وIL-4 (10 نانوغرام/مل)، وضبط تركيز الخلية إلى 1×106/مل بعد العد.
3) أضف إلى لوحات الثقافة ذات 24 بئرًا وأضف محفزات النضج مثل TNF-α (250 وحدة/مل), إل بي إس (1) ميكروجرام/مل)، أو CD40L (1 ميكروجرام/مل).
4) الثقافة في درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون2 حاضنة لمدة يومين.
5) جمع الخلايا المعلقة والخلايا التي تنمو بشكل فضفاض ملتصقة بالجدار، وهي الخلايا الشجيرية الناضجة.
3.2【طريقة الإنتاج الضخم BMDC】-طريقة الابن
【خلفية】
أ. يمكن الحصول على 30-40×10 بهذه الطريقة.6 DC/mouse في غضون 7 أيام، وهو ما يزيد بمقدار 7-10 مرات عن طريقة Inaba الكلاسيكية. بعد طرد DC من خلال تدرج 14.5% من الميتريزاميد، يمكن أن تصل النقاء (أي خلايا CD11c+/I-Ab+) إلى 85-95%.
ب. إن قدرة الخلايا المتغصنة على البلعمة الذاتية التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة أضعف من قدرة طريقة إينابا الكلاسيكية، ولكن كمية IL-12p70 المفرزة مماثلة.
ج. تتمتع الخلايا المتغصنة المتولدة بهذه الطريقة بقدرة تحفيز أقوى في تفاعل الخلايا الليمفاوية المختلطة مقارنة بطريقة إينابا الكلاسيكية.
د. يمكن للخلايا التغصنية المتغصنة التي يتم الحصول عليها بهذه الطريقة أن تحفز استجابة أقوى للخلايا التائية المحددة.
هـ. باختصار، يمكن لطريقة Son الحصول على BMDC أكثر نضجًا من الطريقة الكلاسيكية.
【خطوات الزراعة】
3.2.1 الحصول على خلايا نخاع العظم للفأر
انظر الخطوات المقابلة في طريقة Inaba (المعدلة).
3.2.2 إعداد كميات كبيرة من BMDC
1) قم بعد خلايا نخاع العظم للفأر التي تم الحصول عليها في الخطوة 1 واضبط تركيز الخلايا على 2×105/مل مع وسط الثقافة الكاملة RPMI 1640 يحتوي على 10٪ FBS.
2) انشر في أطباق ثقافة مكونة من 6 آبار، 5 مل من الخلايا لكل بئر، أضف GM-CSF المعاد تركيبه من الفأر (1000) وحدة/مل) وIL-4 (1000 وحدة/مل)، والثقافة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 حاضنة.
3) في اليوم الرابع من الثقافة، استكمل نظام الثقافة باستخدام GM-CSF الفأري المعاد تركيبه (1000) وحدة/مل) وIL-4 (1000 وحدة/مل).
4) قم بجمع الخلايا الجذعية في اليوم السابع من الثقافة، ثم أعد تعليقها مع 2-4 مل من وسط الثقافة الكامل RPMI 1640، يضاف إلى حجم متساوٍ من 14.5% (وزن/حجم) من ميبانيما، ثم يتم الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 ثانية. الحد الأدنى عند 1200xg.
5) قم بجمع الطبقة الوسطى ثم اغسلها ثلاث مرات باستخدام وسط الثقافة الكامل RPMI 1640 لاستخدامها لاحقًا.
[ملحوظة] في هذه المرحلة، لا يزال DC عبارة عن BMDC غير ناضج. إذا كنت ترغب في زيادة نضجه، فيرجى الانتقال إلى الخطوة 3.
3.2.3 النضج الكامل لشركة BMDC
1) تم إعادة زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم التي تم جمعها في الخطوة 2.4، وتم إضافة GM-CSF للفأر المعاد تركيبه (1000) وحدة/مل) وIL-4 (1000 وحدة/مل)، وكذلك LPS (1-10 ميكروجرام/مل) إلى نظام الثقافة
2) تم زراعته في درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون2 حاضنة لمدة يومين للحصول على خلايا BMDC ناضجة.
3.3【طريقة تحضير كتلة BMDC】-طريقة لوتز
【خلفية】
أ. طريقة لوتز مشابهة لطريقة سون، وكلا الطريقتين يمكنهما تحضير BMDC بكميات كبيرة، ولكن طريقة لوتز أكثر استخدامًا من طريقة سون.
ب. يمكن لهذه الطريقة الحصول على المزيد من BMDC، حتى 1-3 × 108 DC/mouse، ويمكن أن تصل النقاء إلى 90-95٪؛
ج. تركيز السيتوكين المستخدم في هذه الطريقة أقل بكثير من تركيز طريقة سون، 200 فقط وحدة/ملوينخفض إلى 30-100 وحدة/مل من اليوم الثامن إلى اليوم العاشر من الثقافة، مما قد يوفر تكلفة الكاشف بشكل كبير؛
د. الفرق الأكبر بين هذه الطريقة وطريقة إينابا الكلاسيكية وطريقة سون هو أن خلايا نخاع العظم تُزرع في طبق زراعة بكتيرية (طبق بتري) بدلاً من طبق زراعة الخلايا. وأوضح إينابا أن طبق زراعة البكتيريا ليس من السهل على الخلايا البلعمية في نخاع العظم أن تلتصق بالجدار، وبالتالي تثبيط نمو الخلايا البلعمية وتجنب التأثير المثبط للخلايا البلعمية على نضوج الخلايا التغصنية. قد يكون هذا هو السبب الرئيسي وراء قدرة هذه الطريقة على الحصول على عدد كبير من الخلايا البلعمية المتغصنة عند كثافة طلاء أقل.
هـ. ومع ذلك، فإن وقت زراعة هذه الطريقة طويل نسبيًا، ويتطلب 10-12 يومًا. من ناحية، هذا للحصول على المزيد من الخلايا الجذعية المكونة للدم. من ناحية أخرى، من الصعب أن تبقى معظم الخلايا الحبيبية واللمفاوية على قيد الحياة لفترة طويلة، لذلك يمكن تحسين نقاء الخلايا الجذعية المكونة للدم التي تم الحصول عليها في النهاية؛
ف. تستخدم هذه الطريقة فقط GM-CSF لزراعة الحث، وتحتوي الخلايا الجذعية المكونة للدم التي تم الحصول عليها على كل من الخلايا الشجرية الناضجة وغير الناضجة. لتحسين النضج بشكل أكبر، يجب استخدام LPS أو TNF-α لمدة 1-2 يوم آخر من الحث، وسيصل محتوى الخلايا الشجرية الناضجة إلى 50-70%.
【خطوات الزراعة】
3.3.1 الحصول على خلايا نخاع العظم للفأر
انظر الخطوات المقابلة في طريقة إينابا (المعدلة)، ولاحظ أنه يجب حذف خطوة تحلل الدم.
3.3.2 التحضير على نطاق واسع لـ BMDC
1) قم بعد خلايا نخاع العظم للفأر التي تم الحصول عليها في الخطوة 1 واضبط تركيز الخلايا على 2×105/مل مع وسط الثقافة الكاملة RPMI 1640 يحتوي على 10٪ FBS؛
2) انشر في أطباق زراعة بكتيرية مقاس 100 مم (طبق بتري)، 10 مل من الخلايا لكل طبق، وأضف GM-CSF للفأر المعاد تركيبه (200) وحدة/مل)، والثقافة عند 37 درجة مئوية، وحاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون؛
[ملحوظة] يتم هنا استخدام أطباق زراعة البكتيريا، وليس أطباق زراعة الخلايا.
3) في اليوم الثالث، أضف 10 مل من وسط الثقافة الكامل الذي يحتوي على 20 نانوغرام/مل عامل نمو الخلايا المحببة لدى الفأر المعاد تركيبه إلى طبق الثقافة؛
4) في اليومين السادس والثامن، قم بتغيير نصف الوسط، أي جمع وسط الثقافة القديم، ثم أعد تعليق حبيبات الخلايا مع وسط الثقافة الكامل المحتوي على 20 نانوغرام/مل تم إعادة تركيب GM-CSF للفأر بعد الطرد المركزي، ثم تم وضع تعليق الخلية مرة أخرى في الطبق الأصلي؛
5) في اليوم العاشر، يمكن جمع الخلايا، وهي الخلايا BMDCs.
3.3.3 النضج الكامل لخلايا الدم البيضاء النخاعية
1) يتم جمع الخلايا المعلقة عن طريق نفخ الخلايا التغصنية بلطف في اليوم العاشر من الثقافة باستخدام ماصة، ثم يتم الطرد المركزي بسرعة 300xg لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة؛
2) تخلص من السائل العلوي، ثم أعد تعليق حبيبات الخلايا باستخدام 10 مل من وسط الثقافة الكاملة RPMI 1640، ثم انشرها على لوحة ثقافة خلايا مقاس 100 مم؛
3) أضف GM-CSF المعاد تركيبه من الفأر (100 وحدة/مل) وTNF-α (500 وحدة/مل)، أو GM-CSF الفأري المعاد تركيبه (100 وحدة/مل) و LPS (1 ميكروجرام/مل)؛
4) استمر في الزراعة في درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون2 حاضنة لمدة 1-2 يوم.
4. تحديد الخلايا الجذعية المكونة للدم
ل الملاحظة المورفولوجية: تنمو معظم الخلايا BMDC في مستعمرات، وتحتوي الخلايا على نتوءات شجرية متعددة، والتي تكون أكثر وضوحًا في الخلايا BMDC الناضجة.
ل تحليل النمط الظاهري للخلية: تم استخدام قياس التدفق الخلوي للكشف عن التعبير عن جزيئات CD11c وCD40 وCD80 وCD86 وMHC class II (IA/IE) على سطح الخلايا التغصنية. تعبر الخلايا الجذعية البلعمية عن هذه الجزيئات بشكل كبير، وسوف يزداد التعبير عن هذه الجزيئات في الخلايا الجذعية البلعمية الناضجة تمامًا.
ل تفاعل الخلايا الليمفاوية المختلطة (MLR): تمتلك الخلايا BMDC قدرة تحفيزية قوية، وكلما زاد النضج، زادت القدرة التحفيزية.
5. كيفية اختيار محفز النضج؟
إن LPS وCD40L وTNF-α هي عوامل حث نضج شائعة الاستخدام وفعالة لكل من الخلايا المتغصنة البشرية والخلايا المتغصنة لدى الفئران. إن TNF-a لديه أضعف قدرة على حث نضج الخلايا المتغصنة بين الثلاثة. إن LPS وCD40L كلاهما عوامل حث قوية لنضج الخلايا المتغصنة بالكامل في المختبر. إن نضج الخلايا المتغصنة المستحث بواسطة كل منهما متشابه، ولكن طيف السيتوكين المستحث مختلف. تُظهر الخلايا المتغصنة الناضجة المستحثة بواسطة CD40L أقوى قدرة تنظيمية مناعية في الجسم الحي، بما في ذلك توليد الاستجابات المناعية الوقائية والعلاجية للورم. إن التركيز المستخدم لتحفيز النضج الكامل للخلايا المتغصنة باستخدام LPS هو عمومًا 1-10 ميكروجرام/مل، ولكن في الواقع 0.1 ميكروجرام/مل له تأثير قوي جدًا، ولكن لأغراض التأمين، 1 يستخدم بشكل عام ميكروجرام/مل. تجدر الإشارة إلى أن جزيئات CD40L تنتمي إلى عائلة ربيطات TNF، والتي تتميز بحقيقة أنها لا يمكنها العمل إلا بعد تكوين ثلاثيات. لذلك، من الأفضل استخدام بروتين ثلاثي CD40L المعاد تركيبه لتحفيز الخلايا التغصنية، مما سيكون له تأثير جيد. إذا تم استخدام مونومرات CD40L لتحفيز الخلايا التغصنية، فإن النضج ليس مرتفعًا جدًا في معظم الحالات.
6. اختيار طريقة التدريب
الجدول 1.مقارنة بين ثلاث طرق تجريبية شائعة لإعداد BMDC
| المعلمة | طريقة زراعة الخلايا الجذعية BMDC الكلاسيكية - طريقة إينابا | التحضير على نطاق واسع لـ BMDC - طريقة Son | التحضير على نطاق واسع لـ BMDC - طريقة لوتز |
| عدد الاستشهادات في PubMed | 783 | 24 | 663 |
| انحلال نخاع العظم، انحلال خلايا الدم الحمراء | نعم | نعم | لا |
| يقوم نخاع العظم أولاً بإزالة الخلايا الليمفاوية | نعم | لا | لا |
| إزالة الخلايا الحبيبية أثناء الزراعة | نعم | لا | لا |
| حجم الطلاء الأولي لخلايا نخاع العظم | 1مل | 15مل | 10مل |
| حاضنة | لوحات زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرًا | صفيحة زراعة الخلايا ذات 6 آبار | طبق زراعة بكتيرية مقاس 100 مم |
| وسط الثقافة | RPMI 1640+10% FCS | ||
| تركيز GM-CSF في الفأر | 200-1000 وحدة/مل | التركيز الأولي المضاف هو 125-1000 وحدة/مل في اليومين الرابع والسابع، تتم إضافة كميات كافية من GM-CSF وIL-4 إلى نظام الثقافة. | التركيز المضاف الأولي هو 200 وحدة/مل.3-100 وحدة/مل بعد اليوم العاشر |
| الفأر IL-4 | لا حاجة | يحتاج،التركيز هو نفسه مثل GM-CSF | لا حاجة |
| طريقة تبادل السوائل | في اليوم الثاني والرابع، تخلص من 50% -75% من وسط الثقافة القديم (الذي يحتوي على خلايا) واستبدله بوسط ثقافة كامل جديد يحتوي على كمية كافية من GM-CSF. | / | في اليوم الثالث، تمت إضافة حجم متساوٍ من وسط الثقافة الكامل المحتوي على GM-CSF. في الأيام السادس والثامن والعاشر، تم استبدال نصف الوسط. تم شفط وسط الثقافة القديم (المحتوي على الخلايا) وطرده بالطرد المركزي وإعادة تعليقه في وسط ثقافة كامل جديد يحتوي على GM-CSF ثم وضعه مرة أخرى. |
| وقت الثقافة قبل العبور (التوسع) | 6 أيام | 7 أيام | 10 أيام |
| وقت الثقافة بعد المرور (النضج) | 2 يوم | لا أحد | 1-2 يوم |
| محفز النضج الكامل | عامل نخر الورم-أ(250 وحدة/مل) | ل ب س (1-10) ميكروجرام/مل) | عامل نخر الورم-أ(250 وحدة/مل)أو LPS(1) ميكروجرام/مل) |
| وقت حصاد الخلايا التغصنية | 7-8 أيام | 7-8 أيام | 10-13 يوما |
| نقاء التيار المستمر | اليوم الثامن:60-70% | اليوم السابع:85-95% | اليوم 10-12:80-90% |
| إنتاج DC/الماوس | (5-7)×106 | (3-4)×107 | (1-3)×108 |
7. الكواشف الثقافية الموصى بها
| اسم المنتج | قطة | مقاس |
| 91108اللغة الاسبانية | 5 ميكروجرام/50 ميكروجرام/100 ميكروجرام/500 ميكروجرام | |
| 90144ES | 5 ميكروجرام/50 ميكروجرام/100 ميكروجرام/500 ميكروجرام | |
| 90621ES | 5 ميكروجرام/20 ميكروجرام/50 ميكروجرام/500 ميكروجرام | |
| 94016ES | 25 ميكروجرام/100 ميكروجرام/500 ميكروجرام |