1.خلفية عن اللامينين 521
يعد اللامينين 521 (LN521) بروتينًا رئيسيًا لالتصاق الخلايا في الخلايا الجذعية الطبيعية ومصفوفة لزراعة وتوسيع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hES) والخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (hiPSC). يرتبط LN521 بمستقبلات سطح الخلية وينشط مسارات إشارات الخلية، مما يؤدي إلى إنتاج خلايا أكثر وظيفية.
يعمل Laminin 521 على إعادة إنتاج بيئة hPSC ذات الصلة بيولوجيًا في المختبر، ويعزز الالتصاق والبقاء العالي والتجديد الذاتي القوي طويل الأمد لـ hPSC، وهو بروتين مصفوفة رئيسي يدعم نمو الخلايا الجذعية ويحافظ على استقرار بنية الغشاء القاعدي وأدائه. يعد Laminin 521 أيضًا أحد أكثر مصفوفات الثقافة الخالية من المغذيات شيوعًا. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لـ Laminin 521 تحقيق مرور فعال للخلايا الجذعية المستقرة وراثيًا ومتعددة القدرات في خلية واحدة دون إضافة أي مثبطات موت الخلايا المبرمج. تنمو الخلايا في طبقة أحادية موحدة دون الحاجة إلى إزالة أي مناطق تمايز يدويًا. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الدراسات أن LN521 يمكن أن يدعم نمو PSC لأكثر من 10 أجيال دون أي علامات على وجود تشوهات في النمط النووي، ويحافظ على قدرة PSC على التمايز إلى ثلاث طبقات جرثومية من الطبقات الجرثومية الداخلية والمتوسطة والخارجية.
الشكل 1. بنية اللامينين 521 [1]
2. تجربة طلاء اللامينين
2.1 قم بإعداد اللامينين 521 إلى 400 ميكروجرام/مل باستخدام الماء منزوع الأيونات المعقم أو الماء المخصص للحقن. يوصى بالتخفيف إلى 100 ميكروجرام/مل باستخدام 1×DPBS (Ca++/Mg++) المعقم قبل الاستخدام، ثم قم بالتخفيف إلى تركيز عمل يتراوح بين 5-10 ميكروجرام/مل باستخدام DPBS (Ca++/Mg++) المعقم. يختلف تركيز الطلاء حسب نوع الخلايا المزروعة، ويوصى بتحسين البروتوكول التجريبي لتحديد تركيز الطلاء الأمثل للخلايا. راجع الجدول 1 للتركيزات الموصى بها.
ملحوظة: DPBS يحتوي على Ca2+ و ملغ2+ يجب استخدامه، حيث أن الكاتيونات ثنائية التكافؤ مهمة لبنية البروتين ووظيفته. يعتمد التركيز المطلوب لـ Laminin 521 على الخلايا والتطبيق. نوصي بتركيز طلاء أولي يبلغ 0.5 ميكروجرام/سم2.
الجدول 1. الأحجام الموصى بها من محلول عمل اللامينين البشري المعاد تركيبه لأوعية الثقافة المختلفة.
| طبق بتري | تركيز الطلاء (ميكروجرام/مل) | مبلغ الإضافة LN521 | كمية إضافية 1*DPBS | الحجم الاجمالي |
| 6 جيدا | 5 | 50 ميكرولتر/بئر | 950 ميكرولتر/بئر | 1 مل/بئر |
| 12 بئر | 5 | 25 ميكرولتر/بئر | 475 ميكرولتر/بئر | 0.5 مل/بئر |
| 24 بئر | 5 | 15 ميكرولتر/بئر | 285 ميكرولتر/بئر | 0.3 مل/بئر |
| 48 بئر | 5 | 7.5 ميكرولتر/بئر | 142.5 ميكرولتر/بئر | 150 ميكرولتر/بئر |
| 96 جيدا | 5 | 3.5 ميكرولتر/بئر | 66.5 ميكرولتر/بئر | 70 ميكرولتر/بئر |
| طبق بتري 35 ملم | 5 | 50 ميكرولتر/بئر | 950 ميكرولتر/بئر | 1 مل/بئر |
| طبق بتري 60 ملم | 5 | 100 ميكرولتر/بئر | 1900 ميكرولتر/بئر | 2 مل/بئر |
| طبق بتري مقاس 100 مم | 5 | 300 ميكرولتر/بئر | 5700 ميكرولتر/بئر | 6 مل/بئر |
يعتمد الحجم المذكور أعلاه على تركيز طلاء يبلغ 5 ميكروجرام/مل.
2.2 أضف الحجم المحدد من خليط اللامينين-DPBS إلى كل بئر ورجّه برفق. تأكد من تغطية السطح بالكامل بمحلول طلاء اللامينين، حيث إن الأسطح غير المطلية لا تدعم نمو الخلايا.
2.3. ضع اللوحة في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واحتضنها طوال الليل. الحد الأدنى لوقت الحضانة هو ساعتان، ولكن يوصى بالحضانة طوال الليل للحصول على ظروف مثالية لزراعة الخلايا. احرص على عدم ترك حاوية الزراعة تجف، مما سيؤدي إلى تعطيل LN521.
2.4. عندما تصبح الخلايا جاهزة للزرع، قم بسحب محلول اللامينين 521.
3. ثقافة الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات
3.1 إذابة الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات (مع أخذ صفيحة ذات 12 بئرًا كمثال)
3.1.1 قم بإزالة الخلايا iPSC من النيتروجين السائل أو الثلج الجاف وقم بتذويبها في ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 ثوانٍ.
3.1.2 قم بتعقيم القوارير المبردة بالكحول بنسبة 75% ثم انقلها إلى سطح العمل.
3.1.3 انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل يحتوي على 9 مل من DMEM‑F12.
3.1.4 قم بطرد أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل بسرعة 300 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3.1.5 تخلص من محلول اللامينين من اللوحة المغلفة المكونة من 12 بئرًا.
3.1.6 تخلص من السائل الخلوي العلوي وأعد تعليق الخلايا iPSC برفق في 1 مل من mTeSR-plus (يحتوي على 10 ميكرومولار من Y-27632) وانقلها إلى الصفيحة المغطاة المكونة من 12 بئرًا. رج الصفيحة لتوزيع الخلايا بالتساوي إلى كثافة خلايا نهائية تبلغ 1×10^5 خلية/بئر واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. تأكد من مرور الثقافة في غضون 4-5 أيام.
3.1.7 قم بإرجاع اللوحة المكونة من 12 بئرًا إلى الحاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية للحضانة.
3.1.8 يجب إزالة وسط الثقافة المحتوي على مثبط ROCK بعد 12-16 ساعة ومواصلة الثقافة في الوسط الخالي من المثبط.
الجدول 2. كثافة بذر الخلايا في أوعية الثقافة المختلفة، عدد الخلايا المحدد وفقًا لمعدل نمو الخلايا
| أوعية زراعة الخلايا | 6 جيدا | 12 بئر | 24 بئر | 96 جيدا |
| رقم الخلية | 2.5~3.5×105 | 6~8×104 | 3~4×104 | 0.5~1×104 |
3.2. بروتوكول مرور الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات
3.2.1 تخلص من المحلول العلوي للثقافة واشطفه بـ 1 مل من PBS (Ca2O3).‑‑/ملغ‑‑).
ملحوظة: استخدم PBS بدون Ca2+ و Mg2+، حيث أن الكاتيونات ثنائية التكافؤ لها تأثير سلبي على بعض إنزيمات التفكك.
3.2.2 تخلص من PBS وأضف 0.5 مل من كاشف تفكك الخلايا اللطيف.حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 6-8 دقائق أو مراقبته تحت المجهر حتى تصبح الخلايا غير مرتبطة بالصفيحة.
3.2.3 أضف حجمًا متساويًا من DMEM-F12، واخلط الخلايا بلطف، ثم انقلها إلى أنبوب الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة، وقم بالطرد المركزي بسرعة 300 جم لمدة 5 دقائق.
3.2.4 قبل تمرير الخلايا، قم بإعداد صفيحة مغلفة باللامين مكونة من 12 بئرًا.
3.2.5 تخلص من السائل العلوي وأعد تعليق الخلايا في وسط mTeSR‑plus الذي يحتوي على 10 ميكرومتر Y‑27632.
3.2.6 انقل الخلايا إلى الصفيحة المغلفة باللامينين والمكونة من 12 بئرًا. رج الصفيحة برفق لتوزيع الخلايا بالتساوي واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 10 إلى 20 دقيقة.
3.2.7 ضع اللوحة المكونة من 12 بئرًا في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وقم بالحضانة.
ملحوظة: تتميز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المحفزة بسرعة التمايز والموت بعد نموها إلى طبقة أحادية. وللحفاظ على النمو والتعددية، يجب أن تمر قبل أن تتجمع.
3.3. الحفظ بالتبريد للخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات
3.3.1 تحضير كاشف تفكك الخلايا اللطيف.
3.3.2 قم بإجراء فصل الخلايا وفقًا لبروتوكول مرور الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات، واستخدم عدد العضيات الخلوية للتأكد من كثافة الخلايا قبل التجميد.
3.3.3 يجب تجميد كل أنبوب من الخلايا عند كثافة خلايا 1-2×10^6. اتبع خطوات الطرد المركزي وإزالة وسط زراعة الخلايا في بروتوكول مرور الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات. أعد تعليق حبيبات الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات المعزولة في حجم مناسب من محلول الحفظ بالتبريد
3.3.4 أضف 1 مل من حبيبات حفظ الخلايا بالتبريد المعاد تعليقها إلى أنبوب حفظ بالتبريد سعة 1.5 مل، وقم بإجراء التبريد المبرمج، ثم انقلها إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأمد.
4. ملاحظات هامة حول طلاء اللامينين
4.1. يجب تنفيذ جميع الخطوات في البروتوكول التجريبي في ظل ظروف معقمة.
4.2. تجنب تعريض اللامينين لدرجة حرارة الغرفة لفترة طويلة.
4.3. تجنب التجميد والذوبان المتكرر
4.4. بعد إذابة الثلج، يمكن تخزين محلول مخزون البروتين غير المخفف في درجة حرارة تتراوح بين 2 و8 درجات مئوية في ظل ظروف معقمة ويمكن تخزينه بشكل مستقر لمدة 3 أشهر على الأقل.
5. معلومات المنتج ذات الصلة
| اسم المنتج | قطة# | مقاس |
| 92602ES | 10 ميكروجرام/100 ميكروجرام/500 ميكروجرام/1 ملجم |
6. المراجع
[1]Pulido D، Briggs DC، Hua J، Hohenester E. يكشف التحليل البلوري للذراع القصيرة لللامينين β2 كيف يتم إدراج مجال LF في مجموعة منتظمة من مجالات LE. Matrix Biol. 2017 يناير؛ 57-58: 204-212.