1. كيف يمكن منع تحلل الحمض النووي الريبوزي؟

2. ما هي مثبطات RNase؟

3. ماذا يفعل مثبط RNase؟

4. ما هي مميزات مثبطات الريبونوكلياز الفأرية؟

5. المنتجات ذات الصلة والأداء

6. المنتجات ذات الصلة

7. الأسئلة الشائعة

1. كيف يمكن منع تحلل الحمض النووي الريبوزي؟

تلعب إنزيم الريبونوكلياز دورًا مهمًا في عملية التمثيل الغذائي للأحماض النووية ويمكن العثور عليها في أي نوع تقريبًا من بدائيات النوى وحقيقيات النوى. يتم إفراز إنزيم الريبونوكلياز في سوائل الجسم مثل الدموع واللعاب والعرق للدفاع ضد غزو الكائنات الحية الدقيقة، كما يوجد إنزيم الريبونوكلياز أيضًا في بقايا الجلد. ومع ذلك، فإن المصدر الرئيسي لإنزيم الريبونوكلياز في معظم البيئات هو الكائنات الحية الدقيقة، وخاصة البكتيريا والفطريات. إن إنزيم الريبونوكلياز صعب التعطيل للغاية ويتميز بثبات عالٍ ومقاومة للحرارة ومقاومة للأحماض ومقاومة للقلويات. وبعد التحلل الحراري، يمكنه استعادة بنيته الأصلية بسرعة. إن إنزيم الريبونوكلياز نشط للغاية عادةً وموزع على نطاق واسع في كل من الخلايا والأنسجة حقيقية النواة وبدائية النواة. يمكن أن يتحلل الحمض النووي الريبي في العينة تمامًا بكمية ضئيلة من تلوث إنزيم الريبونوكلياز. يمكن أن يأتي تلوث إنزيم الريبونوكلياز في الدراسات من مصادر داخلية وخارجية. إن إنزيم الريبونوكلياز في الخلايا هو في الأساس مصدر داخلي للتلوث، في حين تشمل المصادر الخارجية اللوازم التجريبية وبيئة المختبر والمجربين أنفسهم. إن إنزيمات الريناز، وخاصة أعضاء عائلة الريناز أ، عبارة عن بروتينات صغيرة ومضغوطة تحتوي على عدد قليل من بقايا السيستين القادرة على تكوين العديد من الروابط ثنائية الكبريتيد داخل الجزيء. بعد العودة إلى درجة حرارة الغرفة، وفي غياب عامل تغيير الطبيعة، ستستعيد إنزيمات الريناز المتغيرة بنيتها الطبيعية وبعض وظائفها. لذلك، تحتفظ إنزيمات الريناز بنشاط كبير بعد دورات التجميد والذوبان المتكررة، حتى بعد التعقيم بالبخار. الطبيعة المستقرة لهذه الإنزيمات تجعلها مقاومة للعديد من طرق التطهير، والتي تتطلب عادةً طرقًا كيميائية عدوانية لإزالة إنزيمات الريناز من الأسطح والمحاليل.

لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي المعرض للخطر، يجب اتخاذ احتياطات خاصة عند العمل مع الحمض النووي الريبي. للتحكم في RNase الخارجي، يحتاج المشغل إلى ارتداء القفازات أثناء التجربة، وتغيير القفازات بعد لمس الجلد ومقابض الأبواب وسطح الأشياء العادية. ويحتاج المشغل إلى استخدام مسدس ماصة خاص لتشغيل الحمض النووي الريبي، واستخدام أطراف الجدران الخالية من RNase وأنابيب الطرد المركزي والمركبات والكواشف. ابتعد عن فتحات التهوية أو قم بتغطيتها والنوافذ المفتوحة، واستخدم المناطق الأقل ازدحامًا كمناطق خالية من RNase. وأثناء استخراج الحمض النووي الريبي وتحليله، لا تقم بإجراء تجارب أخرى قد تسبب تلوث RNase.
تتمثل طريقة تثبيط نشاط RNase الداخلي في الحفاظ على العينة أولاً. بعد أخذ عينة من الأنسجة، لا ينبغي استخراج الحمض النووي الريبي مباشرة. بدلاً من ذلك، يجب تجميده بسرعة وتخزينه في بيئة -80 درجة مئوية مع النيتروجين السائل في الوقت المناسب، ويجب إجراء التجربة في أقرب وقت ممكن لتقليل تحلل الحمض النووي الريبي.يتم إضافة مثبطات RNase إلى مستخلص الخلية لتكسير الخلايا وتعطيل RNase في نفس الوقت، مما يقلل من نشاط RNase الذي يتم إطلاقه أثناء تكسير الخلايا. يجب معالجة جميع الكواشف والمعدات بشكل خاص لتعطيل RNases قبل الاستخدام.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مثبطات الحمض النووي الريبي لتثبيط نشاط RNase ومنع تحلل الحمض النووي الريبي بواسطة RNase. هناك عدة أنواع من مثبطات الحمض النووي الريبي:

• ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC): وهو مثبط قوي لـ RNase ولكنه غير كامل. فهو يفسد البروتين من خلال الجمع بين حلقة إيميدازول من الهيستيدين في المجموعة الجينية النشطة لـ RNase، وبالتالي يثبط نشاط الإنزيم.
• إيزوثيوسيانات الغوانيدين: يعتبر حاليًا مثبط RNase الأكثر فعالية، ويمكنه أيضًا تعطيل RNase أثناء تحليل الأنسجة، مما قد يؤدي إلى تدمير بنية الخلية وفصل الحمض النووي عن البروتين النووي، كما أن له تأثيرًا معينًا على RNase تأثير قوي لتشويه الطبيعة.
• معقد ريبونوكليوسيد الفاناديل: معقد يتكون من أيونات أكسيد الفاناديوم والنوكليوسيدات، والتي يمكن أن تتحد مع RNase لتشكيل نظير انتقالي، مما يثبط نشاط RNase بشكل شبه كامل.
• مثبط البروتين لـ RNase (RNasin): وهو جليكوبروتين حمضي يتم استخراجه من كبد الفئران أو القرص البلاستودي البشري، ويعتبر RNasin مثبطًا غير تنافسي لـ RNase، والذي يمكن أن يرتبط بمجموعة متنوعة من RNases، مما يجعله غير نشط.
• أخرى: SDS، اليوريا، تراب الدياتومي، وما إلى ذلك لها أيضًا تأثير مثبط معين على RNase.

2. ما هي مثبطات RNase؟

مثبطات RNase هي فئة من المواد التي يمكنها تثبيط نشاط RNase. تشمل مثبطات RNase الشائعة ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC)، وإيزوثيوسيانات غوانيدين، ومجمعات ريبونوكليوسيد فاناديل (RVC)، ومثبطات البروتين لـ RNase (RNasin). من بينها، DEPC وإيزوثيوسيانات غوانيدين لها سمية معينة، ومجمعات ريبونوكليوسيد فاناديل لها تأثير مثبط على بوليميراز تفاعل البوليميراز المتسلسل، وهو ما لا يساعد في التجارب اللاحقة. RNasin ليس سامًا وهو مثبط غير تنافسي لـ RNase، والذي يمكنه الارتباط بمختلف RNases لتعطيلها.

3. ماذا يفعل مثبط RNase؟

تُستخدم مثبطات RNase عادةً كإجراء احترازي في التلاعبات الأنزيمية بالـ RNA لمنع مثل هذه الملوثات والسيطرة عليها. RNasin هو جليكوبروتين حمضي يتم استخراجه من كبد الفئران أو البلاستوديرم البشري، والذي يمكنه الارتباط بشكل خاص بـ RNase بطريقة غير تساهمية لتكوين مركب، مما يتسبب في تعطيل RNase، وبالتالي حماية سلامة RNA. في الوقت الحاضر، يساعد مثبط RNase في منع تدهور RNA في تطبيقات مثل تخليق cDNA، وRT-PCR، وتفاعلات النسخ/الترجمة في المختبر، أو تنقية RNA.

4. ما هي مميزات مثبطات الريبونوكلياز الفأرية؟

لا تحتوي مثبطات الريبونوكلياز الفأرية المعاد تركيبها على نوعين من السيستينات الحساسة للأكسدة والتي توجد في مثبطات الريبونوكلياز البشرية المنشأ. لذلك، يتمتع مثبط الريبونوكلياز الفأري بنشاط مضاد للأكسدة مرتفع وهو أكثر استقرارًا في تجارب DTT المنخفضة. بالإضافة إلى ذلك، يتمتع مثبط الريبونوكلياز الفأري من Yeasen بالخصائص التالية:
1) تثبيط RNase الشامل: مثبط RNase الفأري من YEASEN يثبط بشكل خاص RNase A، RNase B، RNase C، وما إلى ذلك.
2) ظروف تفاعل متعددة: مثبط RNase نشط عند درجة حموضة 5.0-9.0 و25 درجة مئوية إلى 55 درجة مئوية، وهو مناسب للنسخ العكسي الثابت حراريًا.
3) تجارب متعددة ممكنة في مجرى النهر: لم يتم ملاحظة أي تثبيط لنشاط البوليميراز عند استخدام مثبط RNase مع بوليميراز Taq DNA، أو AMV أو M-MuLV Reverse Transcriptase، أو Phage RNA Polymerases (SP6، T7، أو T3).
4) السلع المنتجة بكميات كبيرة: إن القدرة التصنيعية الواحدة البالغة 2 مليار وحدة تساعد في إدارة التكاليف من خلال ضمان تجانس المنتج واستقرار العرض والالتزام بالوقت.
5) الاتساق من دفعة إلى أخرى: منصة التعبير عن البروتين الناضج والتنقية وفقًا لنظام إدارة الجودة ISO13485، واختبار مراقبة الجودة وفقًا لمتطلبات الجودة لضمان استقرار المنتج بين الدفعات.

5. المنتجات ذات الصلة والأداء

أ. مثبط RNase يمنع نشاط RNase

1 ميكروغرام من إجمالي RNA لخلية HEK، 1 ميكرولتر من مثبط RNase يمكن أن يثبط 5ng RNase بشكل فعال.

الشكل 1. التأثير المثبط لمثبط RNase الفأري.

ب. مثبط RNase يتفوق على المنتجات الأجنبية في اختبار qPCR

تم قياس التأثير المثبط لمثبطات RNase المشتقة من الفئران من شركة Yeasen وR* باستخدام تقنية qPCR في ظل ظروف تجريبية متطابقة، وقد نجح مثبط RNase من مصدر YEASEN الفأري في تثبيط RNase A في النظام بكفاءة. وكان تأثير التثبيط متفوقًا على تأثير المنافسين.

الشكل 2. اختبار تثبيط RNase في التصوير بالرنين المغناطيسي R*

ملاحظة: المنحنيات في الشكل من اليسار إلى اليمين هي: التحكم الإيجابي (RNA فقط، بدون RNase وMRI)، 40 وحدة تصوير بالرنين المغناطيسي، 30 وحدة تصوير بالرنين المغناطيسي، 20 وحدة تصوير بالرنين المغناطيسي، 10 وحدات تصوير بالرنين المغناطيسي، والتحكم السلبي (RNA + RNase، بدون MRI).

الشكل 3. اختبار تثبيط RNase لـ Yeasen MRI

ملاحظة: المنحنيات في الشكل من اليسار إلى اليمين هي: التحكم الإيجابي (RNA فقط، بدون RNase وMRI)، 80 وحدة تصوير بالرنين المغناطيسي، 60 وحدة تصوير بالرنين المغناطيسي، 40 وحدة تصوير بالرنين المغناطيسي، 30 وحدة تصوير بالرنين المغناطيسي، 20 وحدة تصوير بالرنين المغناطيسي، 10 وحدات تصوير بالرنين المغناطيسي، التحكم السلبي (RNA+RNase، بدون MRI).

الشكل 4. نتائج التصوير المقطعي المحوسب لـ RT-qPCR لـ Yeasen MRI وR* MRI

6. المنتجات ذات الصلة

المنتجات ذات الصلة التي يمكن لشركة Yeasen توفيرها موضحة في الجدول 1:

الجدول 1.قائمة المنتجات

7. الأسئلة الشائعة

س1: هل سيكون هناك RNase في مثبط RNase الفأري؟
ج: كل كاشف سوف يكتشف نشاط RNase للتأكد من أن مثبط RNase الفأري لا يسبب تلوث RNase.
س2: هل سيكون لمثبطات RNase الفأرية تأثير على تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل اللاحقة؟
ج: لن يكون له أي تأثير. كل دفعة من مثبطات RNase الفأرية خالية من التلوث الجيني بعد اختبار الجودة ويمكن استخدامها في أبحاث RT-PCR وRT-qPCR.
س3: هل سيتم تعطيل مثبط RNase الفأري؟
ج: سيتم إبطال مفعول المثبطات عند درجات حرارة أعلى من 65 درجة مئوية، كما أن التحريك القوي سيؤدي أيضًا إلى إبطال مفعولها.
س4: ما هي الاحتياطات التي يجب اتخاذها عند استخدام مثبط RNase الفأري لتحضير نظام التفاعل؟
الإجابة: عند تحضير النظام، يمكن إضافة مثبط RNase أولاً قبل إضافة مكونات أخرى قد تؤدي إلى إدخال مصادر تلوث RNase.
س5: هل مثبط RNase الفأري له نشاط نوكلياز داخلي ونوكلياز خارجي؟
الإجابة: لا يوجد نشاط نوكلياز داخلي أو خارجي، مما يساعد على تحسين إنتاجية المنتج.

فيما يتعلق بالقراءة:

مثبطات RNase الفأرية —— القضاء بنجاح على تلوث RNase والحفاظ على الحمض النووي الريبي

اختيار النسخ العكسي

YEASEN UDG القابل للتغير بالحرارة——التحكم بسهولة في تلوث الهباء الجوي

مواد خام عالية الجودة للتضخيم المتساوي الحرارة - تجعل RT-LAMP أكثر حساسية وأسرع!