يمكن لتقنية التضخيم المتساوي الحرارة تحقيق غرض تضخيم تسلسلات حمض نووي محددة في ظل ظروف درجة حرارة ثابتة. نظرًا لخصائص عدم وجود معدات خاصة ووقت تضخيم قصير وحساسية عالية، فقد أظهرت آفاق تطبيق جيدة في الكشف في الموقع والتشخيص في نقطة الرعاية وهي مناسبة جدًا لتطوير أدوات التشخيص الجزيئي.

في سياق جائحة فيروس كورونا المستجد مع تزايد السلالات والقدرة على العدوى، يمكن لتقنية التضخيم المتساوي الحرارة اكتشاف فيروس كورونا المستجد تم تطوير تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بسرعة باستخدام أدوات بسيطة، مما يساعد على حل مشكلة عدم إمكانية تأكيد إصابة بعض مرضى كوفيد-19 بسرعة بسبب وقت الكشف الطويل والمتطلبات العالية لمعدات الكشف وكواشف تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية. إذن ما هو مبدأ RT-LAMP، إحدى تقنيات التضخيم الحراري المتساوي؟ ما هي المواد الخام عالية الجودة التي يمكن لشركة Yeasen توفيرها؟

1. ما هو مبدأ RT-LAMP؟
2. تصميم تمهيدي لـ RT-LAMP
3. ما هي المواد الخام التي يمكن لشركة Yeasen توفيرها؟
4. دليل اختيار المنتج

1. ما هو مبدأ RT-LAMP؟

في عام 2000، أسس العلماء اليابانيون نوتومي وآخرون تقنية جديدة لتضخيم الأحماض النووية تسمى التضخيم الحراري المتساوي بوساطة الحلقة (LAMP). يستخدم LAMP 4 بادئات محددة مصممة لست مناطق من الجين المستهدف، ويستخدم بوليميراز الحمض النووي المزاح للخيوط لتضخيم 109 نسخة من تسلسل الهدف في عشرات الدقائق في ظل ظروف حرارية متساوية (60～65 درجة مئوية). تم الحكم على النتائج من خلال الرحلان الكهربائي للهلام الأجار، وأظهرت النتائج الإيجابية أشرطة على شكل سلم. يتميز LAMP بالخصوصية القوية والحساسية العالية والتشغيل السريع والبسيط والتكلفة المنخفضة. مع التحسين المستمر وإتقان هذه التكنولوجيا، يتم استخدامها حاليًا في الكشف عن الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض المختلفة.

RT-LAMP هي طريقة يتم فيها إضافة النسخ العكسي إلى نظام تضخيم LAMP، والذي يمكنه تحقيق الكشف المباشر عن الحمض النووي الريبي الفيروسي. كفاءة تضخيم LAMP عالية للغاية، لذلك يمكن تضخيم كمية كبيرة من الحمض النووي بكمية صغيرة فقط من cDNA. يتم توفير وقت النسخ العكسي في عملية تضخيم الحمض النووي، وتسريع سرعة اكتشاف الحمض النووي الريبي.

يكون الحمض النووي في حالة توازن ديناميكي عند حوالي 65 درجة مئوية. وتحت تأثير بوليميراز إزاحة السلسلة، بدءًا من الطرف 3' من القطعة F2 من برايمر FIP، يقترن بالتسلسل التكميلي للحمض النووي القالب لبدء تخليق الحمض النووي الإزاحي للسلسلة. يكون برايمر F3 مكملًا لـ F3c في الطرف الأمامي لـ F2c ويتخذ الطرف 3' كنقطة بداية لتوليف الحمض النووي الخاص به بينما يحل محل خيط الحمض النووي الذي تم توليفها بواسطة برايمر FIP الرائد بفعل بوليميراز إزاحة السلسلة. يمتد للأمام. يشكل خيط الحمض النووي الذي تم توليفه بواسطة برايمر F3 الأخير خيطًا مزدوجًا بخيط DNA قالب واحد. يتم استبدال خيط الحمض النووي الذي تم توليفه بواسطة برايمر FIP بخيط برايمر F3 لتوليد خيط واحد. يحتوي هذا الخيط المفرد على قطعتي F1c وF1 مكملتين عند الطرف 5'، لذلك يتم إجراء الاقتران القاعدي الذاتي لتشكيل بنية دائرية. ويتم تهجين برايمر BIP ودمجه مع السلسلة الفردية، ويتم استخدام الطرف 3' من برايمر BIP كنقطة بداية لتركيب سلسلة تكميلية، ويتم فتح البنية في هذه العملية.بعد ذلك، يتم إدخال بادئات مشابهة لـ F3 وB3 من بادئ BIP، ويتم إجراء اقتران تكميلي للقواعد، ويتم تصنيع خيط تكميلي جديد من الطرف 3' كنقطة بداية. توجد تسلسلات تكميلية في كلا طرفي الحمض النووي أحادي السلسلة المستبدل، ويحدث اقتران ذاتي للقواعد لتشكيل بنية دائرية، لذلك تقدم السلسلة بأكملها بنية تشبه الدمبل. هذه البنية هي البنية الأولية لدورة التضخيم لطريقة RT-LAMP.

في البنية على شكل دمبل، يتم تمديد الحمض النووي باستخدام القطعة F1 في الطرف 3' كنقطة بداية واستخدام نفسها كقالب. ويهجن برايمر FIP F2 مع F2c أحادي السلسلة على الحلقة لبدء جولة جديدة من تفاعل إزاحة السلسلة. يتم تفكيك الحمض النووي ثنائي السلسلة المصنوع من القطعة F1، وبالمثل، يتم تكوين بنية دائرية على الحمض النووي. يوجد شكل أحادي السلسلة من B2c على البنية الدائرية، ويهجن B2 على برايمر BIP معه لبدء جولة جديدة من التضخيم، ويتكون هيكل دائري من خلال نفس العملية. وفقًا لهذه العملية، فإن التسلسلات التكميلية على نفس السلسلة تدور من خلال الاقتران، وتمديد السلسلة، وأخيرًا تشكل هياكل بأحجام مختلفة.

2. تصميم تمهيدي لـ RT-LAMP

تصميم البادئ هو المفتاح لنجاح تضخيم واكتشاف RT-LAMP. تتضمن بادئات RT-LAMP بادئين خارجيين (F3 وB3) وبادئين داخليين (FIP وBIP). بادئ F3: البادئ الخارجي العلوي، المكون من منطقة F3، مكمل لمنطقة F3c من الجين المستهدف. بادئ FIP: البادئ الداخلي العلوي، المكون من منطقة F2، منطقة F2c عند الطرف 3' من الجين المستهدف في منطقة F2 مكمل لمنطقة F1c عند الطرف 5' من الجين المستهدف. بادئ BIP: البادئ الداخلي السفلي، المكون من منطقة B2، منطقة B2 مكمل لمنطقة B2c عند الطرف 3' من الجين المستهدف، وله نفس التسلسل مثل منطقة B1c عند الطرف 5' من الجين المستهدف.

على غرار تفاعل البوليميراز المتسلسل، ينبغي لمبادئ تصميم البادئ الانتباه إلى عوامل مثل التركيب القاعدي ومحتوى GC والبنية التحتية. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي ملاحظة النقاط التالية. يبلغ طول الأجزاء الطرفية 5' من البادئات الداخلية FIP وBIP، أي F1c وB1c، بشكل عام من 8 إلى 50 زوجًا قاعديًا. ويفضل أن يكون الطول من 15 إلى 25 زوجًا قاعديًا، وتكون قيمة Tm أكبر من قيم Tm لـ F2 وB2 عند الجزء الطرفي 3'. يبلغ طول الأجزاء الطرفية 3' من البادئات الداخلية FIP وBIP، أي F2 وB2، بشكل عام من 8 إلى 50 زوجًا قاعديًا. ويفضل أن يكون الطول من 15 إلى 25 زوجًا قاعديًا، وتكون قيمة Tm متوافقة مع درجة الحرارة المثلى لبوليميراز DNA Bst المحدد في التجربة. يبلغ طول البادئات الخارجية F3 وB3 بشكل عام من 8 إلى 50 زوجًا قاعديًا. يفضل أن يكون الطول 15-25 bp، وقيمة Tm الخاصة به أصغر من قيمة F2 وB2. عند تصميم البادئات، يجب مراعاة بنية الحلقة وحجم تسلسل الهدف. عندما يكون عدد القواعد في الحلقة أكبر من 40 bp وحجم تسلسل الهدف 130-200 bp، تكون كفاءة التضخيم هي الأعلى.

3. ما هي المواد الخام التي يمكن لشركة Yeasen توفيرها؟

3.1 [ترقية جديدة] Yeasen Bst بوليميراز الحمض النووي الإضافي

تمت ترقيته حديثًا بوليميراز الحمض النووي Hieff™ Bst Plus (الفئة رقم 14402ES، 14403ES) يتم الحصول عليه عن طريق التعبير عن جين بوليميراز الحمض النووي لبكتيريا Bacillus stearothermophilus وتنقيته س يفتقر إلى مجال إكسونوكلياز 5'→3' في E.coli.قدرة إزاحة خيوط الإنزيم قوية، ولها مزايا الحساسية العالية، وكفاءة التضخيم العالية، والتسامح العالي مع dUTP، ويمكن استخدامها على نطاق واسع في الكشف في الوقت الحقيقي عن مسببات الأمراض بناءً على تقنية التضخيم المتساوي الحرارة.

3.1.1 سريع وحساسية عالية

يتميز Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase بحساسية عالية ويمكنه اكتشاف الجين المستهدف حتى 5 نسخ. تكون كمية القالب على مستوى الفمتوغرام (fg)، ومعدل التضخيم أسرع من المنتجات المنافسة.

الشكل 1. تم إجراء تفاعل RT-LAMP باستخدام Yeasen إنزيم بوليميراز الحمض النووي Hieff™ Bst Plus (البرتقالي) وإنزيمات Bst للمنافس N (الرمادي) والمنافس T (الأزرق) لتضخيم فيروس SARS-CoV-2. تظهر النتائج أن إنزيم بوليميراز الحمض النووي Hieff™ Bst Plus من Yeasen يمكنه دائمًا الوصول إلى الحد الأقصى بشكل أسرع من المنتجات المنافسة، كما أن معدل التضخيم أسرع.

4. دليل اختيار المنتج

المنتجات التي تقدمها شركة Yeasen هي كما يلي:

الجدول 1.معلومات المنتج