الأجسام المضادة للبوليميريز المزدوجة للبوليميريز المضادة للبطولة للمساعدة في تقليل التضخيم غير المحدد

التشخيص الجزيئي هو أسرع المجالات الفرعية تطوراً في مجال التشخيص المخبري. يتميز بوقت اكتشاف قصير وحساسية عالية وخصوصية قوية. يستخدم على نطاق واسع في التشخيص المصاحب للأورام وفحص الأمراض المعدية والأمراض الوراثية. في مجال التشخيص الجزيئي، لا يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل منصة التكنولوجيا الأكثر نضجًا مع أكبر حصة في السوق فحسب، بل إنه أيضًا تقنية "المعيار الذهبي" للتشخيص السريري. في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي، تحدث مشكلة التضخيم غير المحدد غالبًا. يؤثر التضخيم غير المحدد بشكل مباشر على تفسير نتائج الكشف وسيؤدي إلى انخفاض حساسية التضخيم وحتى إنتاج شظايا الهدف. كيف يحدث التضخيم غير المحدد وكيف يمكن تجنبه بشكل فعال؟

1. بوليميراز الحمض النووي التقليدي قد يؤدي إلى تضخيم غير محدد

2. يمكن أن تعمل بوليميراز البداية الساخنة على تحسين خصوصية التضخيم

3. يمكن لأجسام مضادة Taq مزدوجة الكتلة أن تعمل على تحسين دقة التضخيم واستقراره بشكل مضاعف

4. عرض أداء لـ Yeasen's Double-Block Taq جسم مضاد

5. معلومات المنتج

1. يمكن أن يؤدي بوليميراز الحمض النووي التقليدي إلى تضخيم غير محدد

إن ضعف خصوصية تسلسل البادئات هو السبب المباشر للتضخيم غير النوعي. وباعتبارها محفزًا لبوليميراز الحمض النووي التقليدي، فإن نشاط إكسونوكليازها يمكن أن يقطع تسلسل بادئ الحمض النووي أثناء تحضير نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل، مما يقلل من خصوصية البادئات.

بالإضافة إلى ذلك، لا يمتلك بوليميراز الحمض النووي التقليدي نشاط إكسونوكلياز فحسب، بل يمتلك أيضًا نشاط بوليميراز. وعلى الرغم من أن درجة حرارة التمدد المثلى لبوليميراز الحمض النووي هي 72 درجة مئوية، إلا أن البوليميراز لا يزال نشطًا في درجة حرارة الغرفة. لذلك، أثناء تحضير تفاعل البوليميراز التسلسلي المتسلسل وعملية التسخين الأولية، قد تشكل البادئات ارتباطًا غير محدد ببعض قوالب السلسلة المفردة وتمتد تحت تأثير بوليميراز الحمض النووي Taq، مما يؤدي إلى تضخيم التسلسلات غير المستهدفة والتأثير على خصوصية التفاعل.

لذلك، غالبًا ما يتم تكوين أنظمة تفاعل البوليميراز المتسلسل على الجليد لتثبيط نشاط بوليميراز الحمض النووي. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة بسيطة ورخيصة، إلا أنها لا تستطيع تثبيط نشاط الإنزيم تمامًا، وبالتالي لا يمكنها القضاء على تضخيم المنتجات غير المحددة.

2. يمكن أن تعمل بوليميراز البداية الساخنة على تحسين خصوصية التضخيم

إن بوليميراز البدء الساخن هو المكون الأساسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل بالبدء الساخن. في درجة حرارة الغرفة، يتم حظر الموقع النشط لبوليميراز الحمض النووي بواسطة معدِّل إنزيمي. فقط بعد تحلل تفاعل البوليميراز المتسلسل عند 95 درجة مئوية، يختفي معدِّل الإنزيم ويبدأ نشاط الإنزيم، مما يتجنب التضخيم غير المحدد الذي يسببه الإنزيم.

في الوقت الحاضر، تتضمن طرق تعديل إنزيم البوليميراز بالبدء الساخن المستخدمة بشكل شائع في السوق بشكل أساسي الطريقة الكيميائية وطريقة الربيطة وطريقة الأجسام المضادة. من بينها، يعتبر تأثير الحجب لبوليميراز البدء الساخن المعدل بالأجسام المضادة هو الأفضل، كما أن سرعة إطلاق نشاط الإنزيم سريعة، مما يمكن أن يقلل بشكل كبير من وقت تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل. إنها طريقة تعديل إنزيم البدء الساخن المستخدمة على نطاق واسع في سوق التشخيص المخبري.

ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن طريقة البدء الساخن للأجسام المضادة التقليدية تمنع فقط نشاط بوليميراز 5'→3' لبوليميراز Taq DNA، والذي يمكنه فقط منع التضخيم غير المحدد الناجم عن عدم التطابق أو ثنائي البادئ في درجات الحرارة المنخفضة.ومع ذلك، وكما ذكرنا أعلاه، فإن بوليميراز Taq DNA ليس له نشاط بوليميراز 5'→3' فحسب، بل له أيضًا نشاط إكسونوكلياز 5'→3'. وقد يؤدي نشاط إكسونوكلياز هذا إلى تحلل المجسات غير المتطابقة أو المواد الأخرى عند درجات حرارة منخفضة، مما يؤدي إلى ظهور بعض الإشارات غير المحددة.

3. يمكن لأجسام مضادة Taq مزدوجة الكتلة أن تعمل على تحسين خصوصية التضخيم واستقراره بشكل مضاعف

باعتبارها رائدة مبتكرة في صناعة الإنزيمات الجزيئية المحلية، تركز شركة Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. (المشار إليها فيما بعد باسم Yeasen) على البحث والتطوير وإنتاج المواد الخام للإنزيمات الجزيئية وتجرؤ على الابتكار. بالاعتماد على منصة فحص الأجسام المضادة الناضجة الخاصة بها، تقوم بفحص الأجسام المضادة الحاجزة باستخدام بوليميراز Taq DNA كجزيء مستهدف. بعد سنوات من البحث المضني وتحسين النظام، طورت جسم مضاد مزدوج الكتلة لبوليميراز الحمض النووي Taqلا يمكنه فقط منع نشاط بوليميراز Taq DNA بوليميراز، بل يمكنه أيضًا منع نشاط إكسونوكلياز Taq DNA بوليميراز. في نهج ثنائي الشق، لا يمكنه فقط منع التضخيم غير المحدد الناجم عن عدم التطابق أو ثنائي البادئ بشكل فعال، بل يمكنه أيضًا منع تدهور المواد من توليد إشارات غير محددة، وتحسين استقرار الكاشف بشكل مضاعف.

4. عرض أداء لـ Yeasen's Double-Block Taq جسم مضاد

4.1 استخدام الأجسام المضادة Taq ذات الكتلة المزدوجة أكثر دقة وحساسية

بعد حجب بوليميراز Taq باستخدام الأجسام المضادة ذات الكتلة المزدوجة لـ Yeasen والأجسام المضادة لشركة T، تم الكشف عن العينات الإيجابية بواسطة ARMS-PCR.

الشكل 1. منحنى تضخيم ARMS-PCR؛ أزرق: جسم مضاد حجب لشركة T؛ الأحمر: جسم مضاد مزدوج الكتلة من Yeasen

من الممكن أن نرى من الشكل 1 أن بوليميراز Taq المحظور بواسطة الأجسام المضادة ذات الكتلة المزدوجة لـ Yeasen يتميز بالكتابة الدقيقة والحساسية العالية في تضخيم ARMS-PCR.

4.2 الأجسام المضادة Taq ذات الكتلة المزدوجة فعالة تم حظر نشاط إكسونوكلياز بوليميراز Taq DNA

تم مطابقة مجسات البادئ المصنعة مع محلول تفاعل بوليميراز Taq DNA المحظور بواسطة الأجسام المضادة غير المغلقة والمزدوجة الحظر على التوالي وتفاعلت عند 40 درجة مئوية للكشف عن إشارات الفلورسنت الخاصة بها.

الشكل 2. الكشف عن كفاءة الحجب للأجسام المضادة ذات الكتلة المزدوجة لنشاط النوكلياز الخارجي؛ الأصفر: مجموعة بوليميراز Taq DNA غير المغلقة؛ أرجواني: مجموعة بوليميراز الحمض النووي Taq محظورة بواسطة جسم مضاد مزدوج الكتلة

يمكن رؤيته من الشكل 2 أن الأجسام المضادة ذات الكتلة المزدوجة يمكنها منع نشاط النوكلياز الخارجي لبوليميراز Taq DNA بشكل فعال.

4.3 يمكن لأجسام Taq المضادة ذات الكتلة المزدوجة أن تعمل على تحسين استقرار كاشف الكشف بشكل فعال

تم حظر بوليميراز Taq DNA باستخدام الأجسام المضادة التقليدية والأجسام المضادة ذات الكتلة المزدوجة على التوالي وتم تكوينها في خليط مسبق كامل يحتوي على مسبار تمهيدي. تم تضخيم 10000 نسخة من بلازميد ASF عند 4 درجات مئوية لمدة 10 أيام أو عند 37 درجة مئوية لمدة 1 و3 و5 أيام. تمت ملاحظة منحنى التضخيم وتغيرات قيمة Ct، وتمت مقارنة تأثيرات الأجسام المضادة التقليدية والأجسام المضادة ذات الكتلة المزدوجة على استقرار محلول تفاعل الخليط المسبق الكامل.

الشكل 3.منحنى التضخيم لـ 10000 نسخة من بلازميد ASF المضخم بواسطة محلول تفاعل حجب الأجسام المضادة التقليدية (أ) والأجسام المضادة مزدوجة الكتلة (ب)؛ أزرق: قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة 10 أيام؛ أحمر: تم وضعه عند 4 درجات مئوية لمدة 0 يوم (مجموعة التحكم)

من الشكل 3، يمكن ملاحظة أن الأجسام المضادة ذات الكتلتين يمكنها الحفاظ على استقرار محلول التفاعل وتحسين استقرار كاشف الكشف بشكل فعال مقارنة بالأجسام المضادة التقليدية. لم يتغير منحنى التضخيم وقيمة Ct بشكل كبير بعد حظر المسبار التمهيدي المحتوي على الخليط بالكامل بواسطة جسم مضاد ذي كتلتين ووضعه عند 4 درجات مئوية لمدة 10 أيام.

الشكل 4. منحنى التضخيم لـ 10000 نسخة من بلازميد ASF المضخم بواسطة محلول تفاعل حجب الأجسام المضادة التقليدية (أ) والأجسام المضادة ذات الكتلة المزدوجة (ب)؛ أزرق: قم بتخزينه عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام؛ الأخضر: 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام؛ الأصفر: 37 درجة مئوية لمدة يوم واحد؛ أحمر: تم وضعه عند 37 درجة مئوية لمدة 0 يوم (تحكم)

من الشكل 4، يمكن ملاحظة أن الأجسام المضادة ذات الكتلتين يمكنها الحفاظ على استقرار محلول التفاعل وتحسين استقرار كاشف الكشف بشكل فعال مقارنة بالأجسام المضادة التقليدية. تحجب الأجسام المضادة ذات الكتلتين الخليط المسبق بالكامل الذي يحتوي على المسبار التمهيدي، ويكون الفرق في قيمة Ct أقل من 0.2 بعد وضعها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 و3 و5 أيام.

4.4 الأجسام المضادة Taq ذات الكتلة المزدوجة تساعد في حل مشكلة الانحراف الأساسي

عندما تتعاون بعض البادئات مع عازل وأدوات معينة، سيكون هناك انحراف في خط الأساس. جرب ياسين العديد من الطرق لتحسين مشكلة خط الأساس ووجد أن الأجسام المضادة ذات الكتلتين كانت أكثر ملاءمة لخط الأساس المستقر.

الشكل 5. منحنى تضخيم الجين N (أ) وجين ACT (ب)؛ الأحمر: جسم مضاد تقليدي؛ أخضر: جسم مضاد مزدوج الكتلة

وكما يمكن أن نرى من الشكل 5، فإن استخدام الأجسام المضادة ذات الكتلة المزدوجة تحت بادئات ومخازن محددة يمكن أن يساعد في حل مشكلة الانجراف الأساسي.

4.5 تم الحصول على خطية جيدة باستخدام الأجسام المضادة Taq ذات الكتلة المزدوجة

تم تضخيم 100000 و 10000 و 1000 و 100 نسخة من البلازميدات المزدوجة ASF/ACT باستخدام محلول التفاعل المحظور بواسطة جسم مضاد مزدوج الكتلة، وتم عمل المنحنى القياسي.

الشكل 6. المنحنيات القياسية لجين ASF (أ) وجين ACT (ب) الناتجين عن محلول التفاعل المزدوج الكتلة

كما يمكن أن نرى من الشكل 6، المنحنى القياسي R2 نسبة جين ASF هي 0.998، وكفاءة التضخيم هي 98.848%؛ المنحنى القياسي R2 بلغت نسبة جين ACT 0.998 وكانت كفاءة التضخيم 98.113%.

4.6 طاقة مزدوجة الكتلة يمكن للأجسام المضادة أن تطلق نشاط الإنزيم بسرعة

تم حظر بوليميراز Taq باستخدام الأجسام المضادة المستوردة من شركة T و جسم مضاد مزدوج الكتلة لـ Yeasen (رقم القط #31303) على التوالي، وتم الكشف عن نشاط الإنزيم بعد صدمة حرارية عند 95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية. ويمكن ملاحظة أن 31303 يمكن أن يطلق أكثر من 95٪ من نشاط الإنزيم بعد صدمة حرارية عند 95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، وهو ما يعادل الأجسام المضادة لشركة T.

الجدول 1. نشاط الإنزيم

4.7 طاقة مزدوجة الكتلة الأجسام المضادة يمكنه منع العديد من أنواع إنزيمات Taq

تم حظر ثلاثة أنواع من إنزيمات Taq (النوع البري و2 من الطفرات) بواسطة الأجسام المضادة ذات الكتلة المزدوجة من Yeasen (cat#31303)، وكانت نسبة الحظر 1 ميكروجرام: 5 وحدات، لقياس قيمة الفلورسنت وكفاءة الختم. يمكن ملاحظة أن التأثير الحاجز للأجسام المضادة ذات الكتلة المزدوجة من Yeasen (cat#31303) أفضل لأنواع مختلفة من إنزيمات Taq.

الجدول 2. كفاءة الحجب لأنواع مختلفة من إنزيمات Taq

4.8 ياسين لم يكن للأجسام المضادة Taq ذات الكتلة المزدوجة أي بقايا جينية في الفئران

باستخدام الماء كقالب للتحكم السلبي وجينوم الفأر كقالب للتحكم الإيجابي، تم تضخيم 31303 دفعة مختلفة. وقد وجد أن الجزء المستهدف لم يتم تضخيمه في العينة، مما يشير إلى عدم وجود بقايا من جينوم الفأر في الأجسام المضادة.

الشكل 7. مخطط الكشف عن بقايا جينوم الفأر

ملحوظة: - هو التحكم السلبي، و+ هو التحكم الإيجابي، و1-5 هي 31303 عينة من دفعات مختلفة

5. معلومات المنتج