إن التضخيم غير النوعي لبوليميراز Taq DNA هو مشكلة شائعة في تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل، والتي تؤثر بشكل مباشر على تفسير نتائج الكشف ويمكن أن تؤدي إلى انخفاض حساسية التضخيم، وحتى انخفاض في إنتاج القطعة المستهدفة. إن استخدام مُعدِّلات الإنزيم لإغلاق المركز النشط لبوليميراز Taq DNA في درجة حرارة الغرفة، وبالتالي تثبيط نشاط بوليميراز DNA لإنزيم Taq في درجة حرارة الغرفة، هو حاليًا الطريقة الأكثر فعالية لقمع التضخيم غير النوعي. إن الأجسام المضادة ذات الختم المزدوج التي طورتها شركة Yisheng لا تغلق نشاط بوليميراز Taq DNA فحسب، بل تغلق أيضًا في نفس الوقت نشاط إكسونوكلياز لبوليميراز Taq DNA. يمنع هذا النهج المزدوج بشكل فعال التضخيم غير النوعي الناجم عن الاقتران الخاطئ أو ثنائيات البادئ ويمنع أيضًا توليد إشارات غير محددة بسبب تدهور المواد، وبالتالي يعزز بشكل مضاعف خصوصية الكاشف. وهذا يتيح لكاشف الكشف التعامل مع النقل أو الاستخدام في درجة حرارة الغرفة بسهولة.

1.خصوصية تضخيم عالية للغاية - يمكن للأجسام المضادة ذات الختم المزدوج أن تغلق في نفس الوقت أنشطة البوليميراز والنوكلياز الخارجي، مما يتجنب التضخيم غير المحدد بشكل فعال ويعزز الخصوصية.

2.حساسية اكتشاف استثنائية - تضمن تركيبة البداية الساخنة اكتشافًا فعالًا للجينات ذات الوفرة المنخفضة، مما يوفر حساسية أعلى.

3.ثبات ممتاز للمنتج - ثابت في الأداء عند وضعه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام أو عند 4 درجات مئوية لمدة 10 أيام.

4.استقرار خط الأساس والخطية الجيدة - معالجة مشكلة انحراف خط الأساس، مما يؤدي إلى خطية ممتازة.

5.إطلاق سريع لنشاط الإنزيم - يمكن إطلاق أكثر من 95% من نشاط الإنزيم عن طريق التسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية.

6.قابلية تطبيق واسعة للإنزيمات - مناسبة لكل من إنزيمات Taq البرية والطافرة، حيث أن كل ملجم من الأجسام المضادة قادر على إغلاق 4-10 KU من إنزيم Taq.

1 منع نشاط نوكلياز بوليميراز الحمض النووي Taq

تم دمج مجسات البادئ الاصطناعي على التوالي في مخاليط التفاعل لبوليميراز Taq DNA والتي كانت إما غير مغلقة أو مغلقة بأجسام مضادة مزدوجة الإغلاق، وتم إجراء التفاعلات عند 40 درجة مئوية. تم الكشف عن إشارات الفلورسنت لكليهما، وتبين أن الأجسام المضادة مزدوجة الإغلاق يمكنها إغلاق نشاط نوكلياز Taq DNA بشكل فعال.

الشكل 2. الكشف عن كفاءة الختم لنشاط نوكلياز الأجسام المضادة المزدوجة الختم.

02 التحقق من حساسية الكشف

وباستخدام الأجسام المضادة ذات الختم المزدوج من Yeasen والأجسام المضادة من T Company لإغلاق إنزيم Taq، متبوعًا باكتشاف عينات إيجابية من خلال تقنية ARMS-PCR، وُجد أن إنزيم Taq المختوم بواسطة الأجسام المضادة ذات الختم المزدوج من Yeasen كان دقيقًا في تضخيم ARMS-PCR بحساسية أعلى.

أحمر: جسم مضاد لـ YEASEN+Taq؛ أزرق:المورد A الجسم المضاد + Taq.

الشكل 3. منحنى التضخيم لـ ARMS-PCR.

03 التحقق من الاستقرار (4 درجة مئوية لمدة 10 أيام، 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام).

باستخدام الأجسام المضادة المغلقة التقليدية والأجسام المضادة المغلقة المزدوجة لمنع بوليميراز Taq DNA على التوالي، يتم بعد ذلك صياغة البوليميراز في محلول مسبق الخلط كامل يحتوي على بادئات ومجسات. يُترك هذا المحلول عند 4 درجات مئوية لمدة 10 أيام أو عند 37 درجة مئوية لمدة 1 و3 و5 أيام، ثم يُستخدم لتضخيم 10000 نسخة من بلازميد ASF. لوحظ عدم وجود تغييرات كبيرة في منحنيات التضخيم وقيم Ct.

الشكل 4. منحنيات التضخيم لـ 10000 نسخة من بلازميد ASF بعد حجب بوليميراز Taq باستخدام الأجسام المضادة التقليدية (أ) والأجسام المضادة ذات الحجب المزدوج (ب)، يتم تضخيمها بواسطة نظام qPCR.

04 الكشف الأساسي

في ظروف معينة حيث يتم استخدام بادئات محددة بالاشتراك مع مخازن وأجهزة معينة، قد تحدث ظاهرة تعرف باسم انحراف خط الأساس. ومع ذلك، فإن استخدام الأجسام المضادة ذات الإغلاق المزدوج يمكن أن يعالج بشكل فعال مشكلة انحراف خط الأساس، وبالتالي تسهيل خط الأساس الأكثر استقرارًا.

الشكل 5. منحنيات التضخيم لجين SARS-CoV-2 N (أ) وجين ACT (ب) في تحليل qPCR.

05 التحقق من الخطية

تم استخدام خليط التفاعل المغلق بأجسام مضادة مزدوجة الغلق لتضخيم 100000 و10000 و1000 و100 نسخة من البلازميد المزدوج ASFV/ACT لتوليد منحنى قياسي. وكما يمكن رؤيته من الشكل 7، فإن كلاهما يظهر خطية جيدة.

الشكل 6. الرسوم البيانية للمنحنيات القياسية لجين ASFV وجين ACT الناتجين باستخدام خليط تفاعل مزدوج الكتلة.

06 اختبار إطلاق النشاط الأنزيمي

وباستخدام الأجسام المضادة ذات الإغلاق المزدوج (رقم القطعة 31303) من شركة Yeasen لإغلاق إنزيم Taq، وتعريضه لصدمة حرارية عند 95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، تم اكتشاف النشاط الأنزيمي. ويمكن ملاحظة أنه بعد صدمة حرارية لمدة 20 ثانية عند 95 درجة مئوية، يمكن لـ 31303 إطلاق أكثر من 95% من النشاط الأنزيمي، وهو ما يضاهي الأجسام المضادة من شركة T.

الجدول 1. صدمة حرارية عند 95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية للإنزيم.

07 كشف بوليميراز Taq المتعدد

تم استخدام الأجسام المضادة ذات الإغلاق المزدوج من Yeasen (Cat#31303) لإغلاق ثلاثة أنواع من بوليميرات Taq (النوع البري + نوعان متحوران)، بنسبة إغلاق 1 ميكروجرام إلى 5 وحدات، وتم قياس قيم الفلورسنت وكفاءة الإغلاق. وقد وجد أنه بالنسبة لأنواع مختلفة من بوليميرات Taq، أظهرت الأجسام المضادة ذات الإغلاق المزدوج من Yeasen (Cat#31303) تأثيرات إغلاق جيدة.

الجدول 2. الكفاءة المحظورة لأنواع مختلفة من بوليميراز Taq.