مع استمرار تقدم الأبحاث الطبية، أصبح العلاج الموجه أكثر نضجًا. وتتلخص فرضية العلاج الموجه في إجراء اختبارات جينية على الأهداف الجزيئية للأدوية لتحديد الطفرات الجينية التي تسبب الاضطرابات الوراثية أو الأورام الخبيثة. وتُعَد تقنية ARMS-PCR طريقة جديدة تعتمد على تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل والتي يمكنها اكتشاف العديد من الطفرات النقطية في الحمض النووي. وهي حاليًا واحدة من أكثر الطرق أهمية وانتشارًا لتحديد الجينات المخصصة للسرطانات. وقد أقر خبراء المجال بفوائد استخدامها العلاجي.

1. كيف تعمل تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالأليل؟
2. كيف يمكن تحسين خصوصية ARMS؟
3. ما هي مميزات المنتجات التي تقدمها شركة Yeasen؟
4. ما هي بيانات أداء المنتج؟
5. كيف يقوم الناس بطلب المنتجات؟

1. كيف تعمل تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالأليل؟

ARMS-PCR هو نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل المقاوم للتضخيم (ARMS-PCR)، والمعروف أيضًا باسم تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالأليل (AS-PCR). يتم تنظيم الامتداد الخاص بالأليل لتحديد الأليل من النوع البري والجين المتحور من النوع البري، ويتم قياس قيمة إشارة الفلورسنت باستخدام تقنية مسبار Taqman.
تم تصميم برايمرات ARMS PCR باستخدام نوكليوتيدات مختلفة عند الطرف 3' من برايمرين علويين للأليل، والبراميران خاصان بالنوع البري والنوع المتحور على التوالي. أثناء التضخيم، لا تتمكن برايمرات علوية لا تتطابق تمامًا مع القالب من تكوين أزواج قواعد تكميلية، مما يؤدي إلى عدم التطابق، وإعاقة الامتداد، وعدم القدرة على توليد منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل، في حين يمكن لأنظمة البرايمرات التي تتطابق مع القالب تضخيم منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المقابلة. قد يصدر الفلوروفور الموجود على مسبار Taqman إشارة فلورية يمكن اكتشافها بواسطة الجهاز، ويمكن التحقق من صحة النمط الجيني من خلال تقييم بيانات الفلورسنت.
تتميز تقنية ARMS بحساسية عالية، ويمكن أن يصل حد الكشف إلى 100 نسخة/مل، ويمكن أن يصل حد الكشف لأنسجة الورم إلى معدل طفرة 0.5%. بالإضافة إلى ذلك، فإن ARMS تستغرق وقتًا طويلاً ومنخفضة التكلفة، والنتائج بديهية وسهلة الحكم عليها. وذلك لأن ARMS جنبًا إلى جنب مع تقنية qPCR أو الرحلان الكهربائي تتطلب تفاعل PCR واحدًا فقط، والذي يستغرق وقتًا أقل. تحتاج فقط إلى تحسين البادئات السابقة لتقنية ARMS، والتي تتميز بتكلفة أقل ونتائج بديهية مقارنة بتقنية PCR في الوقت الفعلي باستخدام مجسات MGB. نظرًا لأن معظم الحمض النووي المستخرج من عينات الأنسجة المضمنة بالبارافين مجزأ، فلا يمكن الحصول على نتائج كشف دقيقة. تم تصميم طريقة ARMS لتقليل طول المنتج المستهدف، وبالتالي معالجة هذه الصعوبة في الأنسجة المضمنة بالبارافين. في الوقت نفسه، تحقق ARMS جنبًا إلى جنب مع منصة PCR تشغيل الأنبوب المغلق، وهو سهل التشغيل ولا يتطلب معالجة المنتج بعد المعالجة، وبالتالي تجنب تلوث منتجات التضخيم إلى أقصى حد.
من الناحية النظرية، يجب أن يكون بوليميراز Taq DNA مكملًا تمامًا للقالب المتبقي في الطرف 3' من البادئ لتنفيذ بلمرة فعالة. ومع ذلك، تتأثر صرامة Taq DNA بعدة عوامل. في بعض الحالات، يمكن أن يستمر التمديد حتى لو لم تكن القاعدة الطرفية 3' للبادئ مكملة للقالب. إذا كان هناك عدم تطابق قاعدة واحدة فقط في الطرف 3'، فيمكن عدم تطابق البادئات وتمديدها، ولكن كفاءة التمديد منخفضة. تتمتع خلع الطرف 3' المختلفة بكفاءة تمديد مختلفة. إذا تم إدخال قواعد غير متطابقة أخرى في الطرف 3'، فإن عدد حالات عدم التطابق يكون كبيرًا جدًا، ولا يمكن تمديد الطرف 3' بعد مستوى معين.لذلك، فإن عدم تطابق قاعدة واحدة فقط في الطرف 3'من البادئ لا يمكنه التمييز بشكل كافٍ بين الأليلين، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة.

2. كيف يمكن تحسين خصوصية ARMS؟

إن التركيز في تحسين خصوصية ARMS هو تحسين خصوصية تمديد البادئ. يمكن إدخال قاعدة غير متطابقة في القاعدة الثانية أو الثالثة من الطرف 3'. تعمل القواعد غير المتطابقة مع القواعد غير المتطابقة في الطرف 3'، وفي القالب الذي لا يكمل الطرف 3'، يتم تقليل معدل تضخيم البادئ. في حين أن البادئات تضخم بشكل طبيعي في القوالب المكملة لنهاياتها 3'، فإن نوع القواعد غير المتطابقة للبادئات يعتمد على نوع عدم تطابق القاعدة في الطرف 3'.
بعد تصميم البادئات الخاصة بـ ARMS، يلزم زوج من مجسات TaqMan لنقل طاقة الرنين الفلوري الخاص بالأليل. تحتوي مجسات TaqMan على صبغتين فلوريتين، الطرف 5' هو جين فلوري، والطرف 3' يحتوي على جين إخماد فلوري عام. في المسبار الكامل، يكون جين الإخماد والجين الفلوري قريبين جدًا من بعضهما البعض مكانيًا، مما يؤدي إلى إخماد الفلورسنت. في الظروف العادية، لا يمكن اكتشاف الفلورسنت المنبعث من الفلوروفور عند الطرف 5'، ويمكن اكتشاف الفلورسنت الخلفي فقط للمطفئ عند الطرف 3'. في عملية تضخيم الجين المستهدف، ستكون كل من بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل والمجسات الموسومة بالفلورسنت مكملة لتسلسل الهدف أثناء إزالة الأكسجين. عندما يواجه إنزيم Taq مسبارًا مرتبطًا بشكل ثابت بالقالب عند تمديد خيط القالب، فإن إكسونوكلياز 5'-3' لإنزيم Taq سوف يتحلل المسبار المحدد المرتبط بالقالب. يتم فصل الفلوروفور الموجود على المسبار بواسطة مساحة فيزيائية، ويختفي تأثير الإخماد، ويتم انبعاث الفلوريسنت. سيؤدي عدم التطابق بين المجسات الفلورية الضعيفة وتسلسلات الهدف إلى تقليل كمية الفلوريسنت المنبعثة.

الشكل 1 المفهوم الأساسي لـ ARMS-PCR

3. ما هي مميزات المنتجات التي تقدمها شركة Yeasen؟

YEASEN Hieff Unicon™ Multiplex ARMS qPCR Mix هي مجموعة تعتمد على مفهوم كتلة التضخيم التي تسمح بالنمط الجيني بوساطة ARMS-PCR بكفاءة.

👍انتقائية عالية: قادرة على تحديد العديد من الطفرات الجينية؛
👍حساسية عالية: يمكن للبادئات الطافرة اكتشاف الطفرات عند تركيزات منخفضة تصل إلى 0.5% في 10 نانوجرام/لتر من الحمض النووي؛
👍سهلة القراءة: النتائج واضحة و تم تقييمها بشكل موضوعي، وهي واضحة ومباشرة وغير معقدة؛
👍سهل التشغيل: متوافق مع مجموعة من معدات تفاعل البوليميراز المتسلسل، وطريقة التشغيل موحدة، ويمكن إنجاز الكشف على متن الطائرة في 90 دقيقة.

4. ما هي بيانات أداء المنتج؟

4.1 تأثير انسداد المنتج المتفوق

التجربة: تم تضخيم 5 لتر من مدخلات القالب، و10 نانوجرام/لتر من القالب من النوع البري، وكميات مكافئة من البلازميد المتحور باستخدام بادئات متحولة
الموقع: KRASG13D (38G>A)
الأحمر: 13755؛ الأزرق: المنافسون

يوضح الشكل 2 أن البادئات من النوع البري تعمل على تضخيم كل من القوالب من النوع البري والطفرة. ووفقًا لمنحنى التضخيم، فإن القالب من النوع البري ليس له ذروة أو أن الفرق في قيمة Ct بين النوع البري والطفرة هو 6-8، مما يسمح بالتمييز بين الجينات من النوع البري والطفرة بشكل فعال.

4.2 معدل اكتشاف المنتج يمكن أن يصل إلى 0.05٪

التجربة 1: تقنية التحضير القياسية للخلط الذاتي (50%): 50 ميكرولترًا من الحمض النووي من النوع البري بتركيز 10 نانوجرام/ميكرولتر و50 ميكرولترًا من 3X103 نسخة من البلازميد المتحور.
الموقع: KRASG13D(38G>A)

الشكل 3. وفقًا لمنحنى التضخيم، يستمر المنتج في العمل بشكل فعال عند تركيز 0.05٪

التجربة 2: تم تخفيف المعيار الذي تم شراؤه بنسبة 5% (50 نانوجرام/ميكرولتر) باستخدام مخفف المكتبة إلى 10 نانوجرام/ميكرولتر، ثم تم تخفيفه مرة أخرى باستخدام 10 نانوجرام/ميكرولتر من الحمض النووي 293 جرام إلى 0.1% و0.05%.
الموقع:L858R
الأحمر: 13755؛ الأزرق: المنافسون

الشكل 4: وفقًا لمنحنى التضخيم، يمكن أن يصل معدل اكتشاف المواضع على خلفية gDNA من النوع البري بمقدار 10ng/μL إلى 0.05%، ويُظهر التحقق اللاحق بالمعايير التجارية أن منتجاتنا تتمتع بمعدل اكتشاف ممتاز.

4.3 استقرار المنتج ممتاز

لا يتأثر تأثير التضخيم والحجب للمنتج بـ 10 دورات من التجميد والذوبان.
التجربة: الأحمر: -20 درجة مئوية؛ الأخضر: تجميد وإذابة حقيقي 5 مرات؛ الأزرق: تجميد وإذابة حقيقي 8 مرات؛ الأرجواني: تجميد وإذابة حقيقي 10 مرات.
الموقع:L858R

يوضح الشكل 5 أن تكرار تجميد وإذابة الكاشف 13755 عشر مرات ليس له تأثير على خصائصه التضخيمية والحجبية.

لا يتأثر تأثيره التكبيري والحجب بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
التجربة: الأحمر: -20 درجة مئوية؛ الأخضر والأرجواني: 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
الموقع:L858R

يوضح الشكل 6 أن سبعة أيام عند 37 درجة مئوية ليس لها تأثير على عملية التضخيم والحجب لكاشف 13755.

5. كيف يقوم الناس بطلب المنتجات؟

تأسست شركة Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. في عام 2014، وهي شركة ذات تكنولوجيا عالية تعمل في مجال البحث والتطوير وإنتاج المواد الخام للإنزيمات والأجسام المضادة للمستضدات. تشمل منتجاتها الإنزيمات التشخيصية الجزيئية والبروتينات والأجسام المضادة المستخدمة في الصناعات الدوائية واختبار سلامة الأغذية والتربية والعدالة وغيرها من الصناعات. نحن ملتزمون بتزويد العملاء في مجال العلوم الحيوية بمنتجات وخدمات عالية الجودة. المنتجات التي يمكن لشركة Yeasen توفيرها هي كما يلي:

الجدول 1: المنتجات التي تقدمها شركة Yeasen