تلوث الهباء الجوي في البيئة التشغيلية هو السبب الأكثر شيوعًا للنتائج الإيجابية الكاذبة في نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل: الاكتشاف الرائد لإنزيم يوراسيل DNA جليكوزيلاز (UDG) من قبل العالم الأمريكي ليندال في E. coli و Bacillus subtilis، وإنشاء نظام لمنع تلوث تفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال استخدام إنزيم UDG مع dUTP.
تتكون إنزيمات UDG المتوفرة تجاريًا بشكل أساسي من نوعين: إنزيمات UDG العادية المشتقة من Escherichia coli و Bacillus subtilis، وإنزيمات UDG القابلة للتأثر بالحرارة والمستمدة من البكتيريا البحرية المحبة للبرودة. تظهر إنزيمات UDG العادية مقاومة أكبر للحرارة، حيث تحتفظ بكمية صغيرة من نشاط جليكوزيلاز اليوراسيل DNA حتى بعد المعالجة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، مما قد يؤدي إلى تدهور منتجات تضخيم الهدف التي تحتوي على dU. بالإضافة إلى ذلك، نظرًا لاستخدام سلالات بكتيرية معدلة وراثيًا (مثل E. coli) للتعبير المؤتلف عن الإنزيمات الجزيئية، فهناك كمية معينة من الحمض النووي الجينومي المضيف المتبقي في هذه الإنزيمات. إلى جانب تأثيرات بيئة التصنيع والمصادر البشرية، فإن منتجات الإنزيمات الجزيئية معرضة بشدة لتلوث الحمض النووي. أثناء اكتشاف مسببات الأمراض، قد يخفي الحمض النووي الملوث الأحماض النووية المستهدفة ذات الوفرة المنخفضة أو يتم اكتشافه بجانبها، وبالتالي يؤثر على تفسير النتائج.
Yeasen UCF.ME Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG)، قابل للتأثر بالحرارة
وصف
جليكوزيلات اليوراسيل DNA من UCF.ME (UDG/UNG)، غير قابلة للتأثر بالحرارة، 1 وحدة/ميكرولتر (رقم الصنف 14466ES) مشتق من البكتيريا البحرية المحبة للبرودة، وهو عبارة عن إنزيم UDG شديد التقلب بالحرارة منخفض البقايا يُعرف باسم UCF.ME. يمكن أن يمنع استخدام هذا المنتج النشاط المتبقي لإنزيمات UDG التقليدية بعد التعطيل من تحلل منتجات التضخيم المحتوية على dU في درجة حرارة الغرفة. كما يمنع البكتيريا الخلفية الموجودة في الإنزيمات الجزيئية من التسبب في نتائج إيجابية خاطئة في تفاعل البوليميراز المتسلسل. لذلك، فإن إدخال إنزيم UDG شديد التقلب بالحرارة منخفض البقايا UCF.ME® أمر بالغ الأهمية لتحديد مسببات الأمراض المعدية بدقة والمساعدة في التشخيص السريري للعدوى والأمراض المعدية.
مزايا المنتج
- بقايا منخفضة للغاية من الحمض النووي الجينومي UCF.ME—E. coli <0.1 نسخة/ وحدة؛
- بقايا نوكلياز منخفضة - لا يوجد بقايا نوكلياز خارجي، أو إنزيم نخر، أو RNase؛
- قدرة هضم قوية - 0.05 وحدة/طن يمكنها هضم 105 نسخة/طن من منتجات dU-DNA؛
- قابلية حرارية جيدة - تعطيل كامل تحت أي ظرف من الظروف مثل 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، أو 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، أو 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛
- متوافق مع أنظمة تفاعل RT-qPCR - لا يؤثر على نظام الكشف حتى عند مستويات الإدخال العالية (نظام تفاعل 2U/20μL).
(1) نقاء البروتين ≥95٪
شكل 1. نتائج الكشف عن نقاء البروتين (SDS-PAGE)
(2) نوكليازات متبقية منخفضة: لا يوجد نوكليازات خارجية متبقية، أو إنزيمات التكسير، أو RNases
شكل 2. نتائج اختبار بقايا النوكلياز
(3) بقايا الحمض النووي الجينومي لـ E. coli < 0.1 نسخة / وحدة، كانت مستويات البقايا أقل بكثير من الكاشف التقليدي
شكل 3. نتائج اختبار بقايا الحمض النووي الجينومي لبكتيريا الإشريكية القولونية
شكل 4. يمكن لإجمالي 0.05 وحدة من إنزيم UDG أن يهضم 10 ^ 5 نسخة / T من منتجات dU-DNA بالكامل.
الشكل 5. بعد 50 درجة مئوية، 10 دقائق؛ 55 درجة مئوية، 5 دقائق؛ 55 درجة مئوية، 10 دقائق؛ 95 درجة مئوية، 5 دقائق من العلاج بالحرارة غير الفعالة، فقدت 14466ES القدرة على الهضم.
الشكل 6. تم تحضير مزيج RT-qPCR باستخدام مسبارين تمهيديين للجينات ORF1ab وN و14466ES. عندما تم حقن 14466ES في نظام التفاعل بكمية 2 وحدة/20 ميكرولتر، لم يكن هناك تثبيط لـ RT-qPCR رد فعل.
توصية المنتج - سلسلة المواد الخام ذات بقايا إنزيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المنخفضة للغاية
| تحديد موقع المنتج | اسم المنتج | قطة |
| منع التلوث - UDG القابل للتأثر بالحرارة | جليكوزيلاز اليوراسيل DNA من UCF.ME (UDG/UNG)، قابل للتغير بالحرارة، 1 وحدة/ميكرولتر | 14466ES |
| بداية ساخنة لبوليميراز الحمض النووي Taq | بوليميراز الحمض النووي Taq الحساس من Hieff UCF.ME Hotstart (5 وحدة/ميكرولتر) | 14314ES |
| النسخ العكسي | إنزيم النسخ العكسي Hifair UCF.ME V (200 وحدة/ميكرولتر) | 14608ES |
| مثبط الريبونوكلياز الفأري | 14672ES |