منذ مارس 2022، حطمت سلالة الطفرة الماكرة أوميكرون مرة أخرى حياة الناس الهادئة، واندلعت أوبئة فيروس كورونا الجديد في جميع أنحاء البلاد وأثرت على 30 مقاطعة (مناطق وبلديات ذاتية الحكم). وباعتبارها وسيلة فعالة للوقاية الدقيقة والسيطرة على وباء SARS-CoV-2، أصبح الكشف عن الأحماض النووية أسلوب حياة طبيعي. "هل أجريت اختبار الحمض النووي اليوم؟" كما أصبح تحية يومية للناس. وبالحديث عن ذلك، هل تعرف ما هي المواد الخام الأساسية اللازمة للكشف عن الأحماض النووية؟ ستقدم هذه المقالة المواد الخام الأساسية الحاسمة في إنزيم الكشف عن الأحماض النووية.

1. عملية الكشف عن الحمض النووي لفيروس SARS-CoV-2

2. الإنزيمات الأساسية في استخلاص الأحماض النووية

3. الإنزيمات الأساسية أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي الكمي

4. إنزيمات أساسية للكشف عن الحمض النووي لفيروس SARS-CoV-2 من شركة Yeasen

1. عملية الكشف عن الحمض النووي لفيروس SARS-CoV-2

إن الإنزيم هو فئة مهمة للغاية من المحفزات الحيوية ذات الكفاءة التحفيزية العالية وخصوصية التفاعل. تتطلب معظم التفاعلات الكيميائية الحيوية مشاركة الإنزيمات. في عملية الكشف عن الحمض النووي لفيروس كورونا المستجد 2019 (كما هو موضح في الشكل 1)، تلعب أنواع مختلفة من الإنزيمات الجزيئية دورًا مهمًا في المراحل التجريبية المختلفة مثل استخلاص الحمض النووي وتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي. بعد ذلك، وفقًا للروابط التجريبية المختلفة في الكشف عن الحمض النووي، سنقوم بفرز المواد الخام الأساسية للإنزيم المستخدمة في عملية الكشف عن الحمض النووي.

الشكل 1. عملية الكشف عن الحمض النووي لفيروس SARS-CoV-2

2. الإنزيمات الأساسية في استخلاص الأحماض النووية

تتضمن عملية استخلاص الحمض النووي لفيروس كورونا الجديد بشكل أساسي خطوتين: التحلل والتنقية. التحلل هو عملية تدمير بنية الخلية للعينة بحيث يكون الحمض النووي في العينة حرًا في نظام التحلل؛ التنقية هي الفصل الكامل للحمض النووي عن المكونات الأخرى في نظام التحلل، مثل البروتين والملح والشوائب الأخرى، وتتطلب عملية التفاعل مشاركة بروتيناز ك، ديوكسي ريبونوكلياز 1 ومثبطات RNase.

2.1 بروتياز ك

إن البروتيناز ك هو بروتياز سيريني ذو نشاط انقسام واسع، ومواقع الانقسام هي الروابط الببتيدية الطرفية الكربوكسيلية للأحماض الأمينية الأليفاتية والعطرية (الشكل 2). في عملية استخلاص الأحماض النووية، يمكن للبروتيناز ك أن يحلل الهستونات التي ترتبط بإحكام بالأحماض النووية، ويعزز فصل الأحماض النووية، ويجعل من السهل استخراج الأحماض النووية للعينة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للبروتيناز ك أن يحلل نشاط هيدرولاز الحمض النووي الريبي (RNase) ويمنع تحلل الحمض النووي الريبي القالب بواسطة هيدرولاز الحمض النووي الريبي.

الشكل 2. مخطط تخطيطي لروابط الببتيد المحللة للبروتيناز ك

ياسين للتكنولوجيا الحيوية بروتيناز ك (رقم الصنف 10401ES) مشتق من سلالة خميرة معاد تركيبها، ونشاطها النوعي ≥30 وحدة/ملجم، وخالي من RNase وDNase، ونشاط إنزيمي مستقر في محلول اليوريا وSDS. وهو نشط في نطاق واسع من الأس الهيدروجيني (pH 4.0~12.0)، ومناسب للانقسام وإزالة البروتينات مثل تحضير عينات التهجين الموضعي وتنقية الأحماض النووية.

2.2 ديوكسي ريبونوكلياز 1

يمكن أن يحفز ديوكسي ريبونوكلياز I (DNase I) أشكالًا مختلفة من الحمض النووي، ويستهدف انقسام الروابط الفوسفوديسترية المجاورة للبيريميدينات، ويولد بولينيوكليوتيدات بمجموعة فوسفات في الطرف 5' ومجموعة هيدروكسيل في الطرف 3'، ويكون متوسط ​​ناتج الهضم هو أصغر بوليتيترا نوكليوتيد.في عملية استخلاص الأحماض النووية لـ SARS-CoV-2، يتم استخدام DNase I بشكل أساسي لإزالة التلوث الجينومي في عينات RNA، وتجنب بقايا DNA في قوالب RNA وتحسين نقاء القوالب.

ياسين للتكنولوجيا الحيوية DNase I (Cat#10325ES) مشتق من سلالات E. coli المعاد تركيبها، وخالية من RNase، ويمكن استخدامها لعلاج عينات RNA المختلفة. النطاق الأمثل لدرجة الحموضة هو 7.0-8.0. في وجود Mg2+، يمكن لـ DNase I شق أي موقع من الحمض النووي ثنائي السلسلة بشكل عشوائي؛ بينما في وجود Mn²⁺يمكن لإنزيم DNase I أن يشق الحمض النووي مزدوج السلسلة في نفس الموقع، مما يشكل نهايات غير حادة أو نهايات لزجة تتدلى منها 1-2 نيوكليوتيد (كما هو موضح في الشكل 3).

الشكل 3. مخطط تخطيطي لإنزيم DNase I وهو يقطع الحمض النووي ثنائي السلسلة في وجود المغنيسيوم²⁺ و من²⁺

2.3 مثبطات الريبونوكلياز

في عملية الكشف عن الحمض النووي لفيروس SARS-CoV-2، قد يؤدي استخلاص وتنقية عينة الحمض النووي أو تحضير نظام التفاعل التجريبي إلى تلوث الريبونيوكلياز (RNase)، مما يؤدي إلى تدهور قالب الحمض النووي الريبي. لتجنب تلوث الريبونيوكلياز، يلزم استخدام مثبط الريبونيوكلياز.

مثبط RNase هو مثبط RNase محدد في المشيمة البشرية، والذي يمكنه الارتباط بـ RNase بشكل خاص لتكوين مركب برابطة غير تساهمية وتعطيل RNase. Yeasen Biotech مثبط الريبونوكلياز الفأري (Cat#10603ES) لا يحتوي على نوعين من السيستينات التي تكون شديدة الحساسية للأكسدة في البروتينات البشرية. يتمتع بنشاط مضاد للأكسدة أعلى ويمكنه تثبيط أنواع مختلفة من RNases (RNase A، B، C) على نطاق واسع، وهو أكثر ملاءمة للتجارب الحساسة لارتفاع نسبة ثنائي ثيوثريتول (DTT) مثل qPCR.

3. الإنزيمات الأساسية أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي الكمي

بعد اكتمال استخراج الحمض النووي من عينة SARS-CoV-2، يمكن استكمال اكتشاف الحمض النووي عن طريق RT-qPCR. في عملية هذه التجارب، تعد بوليميراز الحمض النووي، والنسخ العكسي، وجليكوزيلاز الحمض النووي اليوراسيل، كلها مواد خام أساسية للإنزيم الأساسي.

3.1 النسخ العكسي

بعد الاستخلاص والتنقية، يحتاج RNA لفيروس SARS-CoV-2 إلى النسخ العكسي لتحفيز بلمرة dNTP لتوليد تسلسل cDNA مكمل لـ RNA القالب (الشكل 4). لتفاعل RT-qPCR، يجب اختيار النسخ العكسي المقاوم لدرجات الحرارة العالية. في الوقت الحاضر، يعد النسخ العكسي لـ MMLV هو الأكثر استخدامًا، نظرًا لافتقاره إلى نشاط نوكلياز الحمض النووي وانخفاض نشاط RNase H، فإنه يتمتع بمزايا أكثر في تطبيق استنساخ cDNA.

الشكل 4. مخطط تخطيطي لعملية النسخ العكسي

ياسين للتكنولوجيا الحيوية هيفير™ النسخ العكسي الخامس (Cat#11300ES) هو إنزيم عكسي جديد تم الحصول عليه من خلال تقنية الهندسة الوراثية. يتمتع بثبات حراري جيد ويمكنه تحمل درجات حرارة التفاعل حتى 60 درجة مئوية. كما أنه مناسب للنسخ العكسي لقوالب الحمض النووي الريبي ذات الهياكل الثانوية المعقدة. في الوقت نفسه، يعزز الإنزيم التقارب مع القالب، وهو مناسب للنسخ العكسي لعدد صغير من القوالب والجينات ذات النسخ المنخفضة، ويمكنه تضخيم cDNA حتى 10 كيلو بايت.

3.2 بوليميراز الحمض النووي

بعد اكتمال عملية النسخ العكسي للقالب لتوليد cDNA مزدوج السلسلة، يلزم ظهور بوليميراز الحمض النووي "لاعب الروح" في تفاعل البوليميراز المتسلسل، عن طريق بلمرة الديوكسي ريبونوكليوتيدات الحرة لتمديد سلسلة الحمض النووي، ويتم تضخيم كمية كبيرة من الحمض النووي للقالب في المختبر لتحقيق غرض الكشف عن الأحماض النووية الفيروسية.

بوليميراز الحمض النووي المستخدم عادة في تفاعلات RT-qPCR هو بوليميراز الحمض النووي Taq ذو البداية الساخنة. هذا النوع من الإنزيمات يكون غير نشط في درجة حرارة الغرفة.لا يمتلك نشاط البلمرة إلا بعد البدء الساخن، مما يقلل من توليد الإشارات الخلفية. يحل مشاكل التضخيم غير المحدد الناجم عن تكوين ثنائي البادئ أو عدم التطابق في تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية. في الوقت الحاضر، تتضمن طرق تعديل البدء الساخن لبوليميراز الحمض النووي المستخدمة بشكل شائع التعديل الكيميائي وتعديل الربيطة وتعديل الأجسام المضادة. تظهر مبادئ طرق تعديل البدء الساخن المختلفة في الشكل 5.

الشكل 5. مخطط تخطيطي لأنواع مختلفة من إنزيمات البدء الساخن المعدلة

ياسين للتكنولوجيا الحيوية بوليميراز الحمض النووي Taq عالي التحديد من UNICONTM Hotstart، 5 وحدة/ميكرولتر (رقم القطعة 10726ES) عبارة عن بوليميراز DNA مزدوج الحجب ذو بداية ساخنة مع تقارب قالب عالي. في درجة حرارة الغرفة، لا يتم إنتاج 5'→3' فقط يتم حظر نشاط البوليميراز، ولكن أيضًا 5'→3' يتم حظر نشاط النوكلياز الخارجي. يمكن أن يؤدي التحلل عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية إلى تعطيل الجسم المضاد الحاجز تمامًا، مما يؤدي إلى إطلاق نشاط بوليميراز الحمض النووي ونشاط النوكلياز الخارجي. لا يمكن لميزة الحظر المزدوج أن تمنع بشكل فعال التضخيم غير المحدد الناجم عن عدم التطابق أو ثنائيات البادئ فحسب، بل تمنع أيضًا بشكل فعال انخفاض إشارة الفلورسنت الناجم عن تدهور المسبار. يجعل الضمان المزدوج كواشف الكشف المختبرية أكثر استقرارًا أثناء النقل أو الاستخدام في درجة حرارة الغرفة.

3.3 جليكوزيلاز اليوراسيل DNA

في عملية الكشف عن الحمض النووي لفيروس كورونا الجديد، يعد تلوث الهباء الجوي في بيئة التشغيل العامل الأكثر شيوعًا الذي يسبب نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل الإيجابية الكاذبة. يمكن أن يؤدي إضافة إنزيم UDG (Uracil DNA Glycosylase، uracil DNA glycosylase) إلى نظام التضخيم إلى القضاء بشكل فعال على الملوثات المتبقية من التضخيم (معظمها في شكل هباء جوي) المختلطة في نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل لضمان دقة نتائج التضخيم. يظهر مبدأ مكافحة التلوث لإنزيم UDG في الشكل 6.

الشكل 6. مخطط تخطيطي لمبدأ مكافحة التلوث لإنزيم UDG

ياسين للتكنولوجيا الحيوية إن جليكوزيلاز اليوراسيل DNA (UDG/UNG)، غير قابل للتأثر بالحرارة، 1 وحدة/ميكرولتر (رقم القطعة 10303ES) نشط عند 25-37 درجة مئوية، وحساس للحرارة، ويتوقف نشاطه بشكل لا رجعة فيه عند 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أو 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين. لا يوجد أي بقايا نوكلياز داخلي أو RNase، وبقايا جينوم البكتيريا المضيفة أقل من 10 نسخ. يمكن استخدامه بالتزامن مع بوليميراز Taq DNA الساخن لضمان خصوصية تفاعل التضخيم.

4.إنزيمات أساسية للكشف عن الحمض النووي لفيروس SARS-CoV-2 من Yeasen

فيما يتعلق بالقراءة:

اختيار النسخ العكسي

YEASEN UDG القابل للتغير بالحرارة——التحكم بسهولة في تلوث الهباء الجوي

مثبطات الريبونوكلياز الفأرية - القضاء بنجاح على تلوث الريبونوكلياز والحفاظ على الحمض النووي الريبي