dNTP هو اختصار لثلاثي فوسفات الريبونوكليوتيد المنقوش المستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل، وهو قادر على تضخيم خيط DNA المتنامي. بعبارة أخرى، تتجمع dNTPs في تفاعل البوليميراز المتسلسل مع خيط DNA التكميلي من خلال الروابط الهيدروجينية، وتتوسع خيط DNA المتنامي بمساعدة بوليميراز Taq DNA. ما هو التطبيق المحدد لـ dNTP في تفاعل البوليميراز المتسلسل؟ ما هي الخصائص التي يجب أن تتمتع بها dNTPs عالية النقاء؟

1. ما هي dNTPs؟
2. ما هو تركيز dNTP في PCR؟
3. ما هي الخصائص المطلوبة لـ dNTP عالي النقاء؟
4. المنتجات ذات الصلة والأداء

1. ما هي dNTPs؟

ثلاثي فوسفات الديوكسينوكليوسيد (dNTPs) عبارة عن ثلاثي فوسفات نوكليوسيد يحتوي على ديوكسيريبوز، وهي سلسلة من النوكليوتيدات تتكون من الريبوز وقاعدة وفوسفات. تعد ثلاثيات فوسفات الديوكسينوكليوسيد اللبنات الأساسية لجزيئات الأحماض النووية، وبالتالي فهي مكونات ضرورية لمخاليط تفاعل البوليميراز المتسلسل حيث لا يمكن توليد أي حمض نووي مضخم جديد بدونها. تتكون تسلسلات الحمض النووي من أربعة نيوكليوتيدات ديوكسي أدينوسين ثلاثي الفوسفات (dATP) وديوكسي ثيميدين ثلاثي الفوسفات (dTTP) وديوكسي سيتيدين ثلاثي الفوسفات (dCTP) وديوكسي غوانوزين ثلاثي الفوسفات (dGTP). بالإضافة إلى ذلك، فإن جودة ثلاثيات فوسفات الديوكسينوكليوسيد مهمة أيضًا لنجاح العديد من الإجراءات مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل، وتخليق الحمض النووي التكميلي، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي، والتسلسل، والاستنساخ، ووسم الحمض النووي.

هناك أربعة أنواع من dNTP، أو ثلاثي فوسفات الديوكسينوكليوتيد، يستخدم كل منها قاعدة مختلفة من الحمض النووي: الأدينين (dATP)، والسيتوزين (dCTP)، والجوانين (dGTP)، والثايمين (dTTP). يوفر استخدام dNTP أثناء مرحلة التمديد قواعد مفردة جاهزة للدخول إلى الحمض النووي ومضاعفته، مثل كتل البناء. وبما أن الغرض من هذه التقنية هو تخليق حمض نووي جديد، فإن dNTP يوفر النيوكليوتيدات للشريط "المفكك" باستخدام قالب جانب واحد. وهذا يحول الشريط المفرد من الحمض النووي إلى شريطين، ويمكن أن يستمر بشكل كبير طالما ظلت الكواشف موجودة حتى مرحلة التثبيت النهائية.

2. ما هو تركيز dNTP في PCR؟

إن تفاعل البوليميراز المتسلسل هو تقنية في المختبر لتخليق الحمض النووي يتم إجراؤها لتوليد نسخ متعددة من جزء الحمض النووي المطلوب بحيث يمكن تصوره تحت الرحلان الكهربائي الهلامي. الغرض من تفاعل البوليميراز المتسلسل هو عمل عدد كبير من نسخ الحمض النووي لتطبيقات لاحقة مختلفة في تسلسل الحمض النووي أو مصفوفات الحمض النووي الدقيقة. تتضمن مكوناته قوالب الحمض النووي، والبادئات، والمخازن، وبوليميراز Taq DNA dNTP. لفهم آلية تفاعل البوليميراز المتسلسل، من الضروري فهم أهمية ومبدأ المكونات المستخدمة. dNTP هو أحد المكونات الرئيسية لتفاعل البوليميراز المتسلسل. تتمثل وظيفة dNTPs في تفاعل البوليميراز المتسلسل في تضخيم شريط الحمض النووي المتنامي بمساعدة بوليميراز Taq DNA والجمع مع شريط الحمض النووي التكميلي من خلال الرابطة الهيدروجينية.

تنقسم عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى ثلاث خطوات تعتمد على درجة الحرارة: التحلل، والتلدين، والتمديد. أثناء خطوة التحلل، يتم تحلل الحمض النووي ثنائي السلسلة إلى الحمض النووي أحادي السلسلة. أثناء خطوة التلدين، ترتبط البادئات في الموقع الدقيق لتسلسلها التكميلي، وأثناء خطوة التمديد، تضيف بوليميراز Taq DNA dNTPs إلى خيط الحمض النووي النامي. بمجرد فتح الخيوط وارتباط البادئات بالحمض النووي أحادي السلسلة، تبدأ بوليميراز Taq DNA نشاطها التحفيزي. في الخطوة التالية، تبدأ إضافة dNTPs، والتي ترتبط بمجمع P-DNA بألفة أقل إذا كان النوكليوتيد التكميلي الدقيق موجودًا. بعد فترة وجيزة من صمود بوليميراز Taq DNA، تحدث تفاعلات رابطة هيدروجينية بين القواعد التكميلية وdNTPs. هنا لا يكون النوكليوتيد بأكمله في البداية، ولكن القاعدة (قاعدة النيتروجين) الموجودة على dNTP هي التي تقرر ما إذا كان سيتم الارتباط أم لا.أولاً، إذا وجدت قاعدة تكميلية (A لـ T، G لـ C) على قالب ssDNA، فسوف تشكل رابطة هيدروجينية بينهما. يتم تكوين ثلاث روابط هيدروجينية بين C وG ورابطتين هيدروجينيتين بين A وT. بمجرد تكوين الرابطة الهيدروجينية، يتوافق بوليميراز Taq DNA مع دمج dNTP في شريط DNA المتنامي عن طريق تكوين رابطة فوسفوديستر. الآن بعد تكوين الرابطة الفوسفوديستر، يذهب بوليميراز Taq DNA إلى خطوة أبعد في إضافة dNTPs جديدة. يتم تكوين رابطة فوسفوديستر بين 3'OH من البادئ و5'P من dNTP. بعد الرابطة الهيدروجينية، يحفز بوليميراز Taq DNA التفاعل عن طريق إزالة جاما وبيتا فوسفات من ثلاثي فوسفات dNTPs. بعد اكتمال التفاعل، يتم إطلاق اثنين من بيروفوسفات (PPi). لكن الحركية الدقيقة لتفاعل dNTPs وبوليميراز Taq في تفاعلات PCR تظل غير معروفة.

تُضاف هذه النوكليوتيدات الأربعة عادةً إلى تفاعل PCR بكميات متساوية من أجل دمج مثالي للقواعد. ومع ذلك، في مواقف معينة مثل الطفرات العشوائية عن طريق تفاعل PCR، يتم توفير تركيزات غير متوازنة من dNTP عمدًا لتعزيز درجة أعلى من سوء الدمج بواسطة بوليميراز الحمض النووي غير المصحح. العامل الذي يحدد الحد الأدنى لتركيز dNTP هو طول الحمض النووي وتركيب التسلسل المستهدف. في تفاعل PCR، يكون dNTP عمومًا 50-200 ميكرومول/لتر. عندما يكون تركيز dNTP النهائي أكبر من 50 مليمول/لتر، فإنه يمكن أن يثبط نشاط بوليميراز الحمض النووي Taq. يجب أن تكون تركيزات dNTP الأربعة متساوية لتقليل سوء الدمج أثناء التضخيم بسبب نقص dNTP واحد.

في تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل الشائعة، يكون التركيز النهائي الموصى به لكل dNTP عادةً 0.2 مليمول. قد تكون التركيزات الأعلى مفيدة في بعض الحالات، وخاصة في وجود تركيزات عالية من المغنيسيوم²⁺، مثل المغنيسيوم²⁺ يرتبط بـ dNTPs ويقلل من معدل دمجها، مما يزيد من المعدل غير المحدد. يحتوي dNTP على الفوسفات، والذي يمكن أن يتحد مع Mg²⁺ لتقليل تركيز الماغنيسيوم الحر²⁺وبالتالي فإن التغير في تركيزه سوف يؤثر على التركيز الفعال لـ Mg²⁺. في ظل ظروف تركيز عالية من الحمض النووي وdNTP، فإن Mg²⁺ يجب تعديل التركيز وفقًا لذلك. كما أن ندرة dNTPs تؤدي إلى منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المكتملة. ومع ذلك، فإن dNTPs التي تتجاوز التركيزات المثلى يمكن أن تمنع تفاعل البوليميراز المتسلسل. من أجل الدمج الفعال بواسطة بوليميراز الحمض النووي، يجب أن تكون dNTPs الحرة موجودة في التفاعل بتركيز لا يقل عن 0.01-0.015 مليمول.

3. ما هي الخصائص المطلوبة لـ dNTP عالي النقاء؟

منذ اكتشافه، أصبح تفاعل البوليميراز المتسلسل أداة لا مثيل لها تستخدم في البحث الجيني الجزيئي. يتم استخدام dNTP في تفاعل البوليميراز المتسلسل لتوسيع خيط الحمض النووي المتنامي. حتى لو كانت جودة dNTP في النظام رديئة، فسيكون لها تأثير سلبي على خصائص المنتج النهائي. إن dNTP عالي النقاء من Yeasen مناسب لجميع أنواع تطبيقات تخليق الحمض النووي شديدة الحساسية والقابلة للتكرار.

تقدم شركة Yeasen نوكليوتيدات جاهزة للاستخدام من الدرجة GMP، ومجموعات ومخاليط، يتم توفيرها كأملاح صوديوم في مياه نقية بدرجة حموضة 7.0. تعمل عملية التصنيع على التخلص من الشوائب ومثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاصة، ويتم تصنيع dNTPs خصيصًا لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية. يتم تنقية dNTPs باستخدام HPLC التحضيري وتتمتع بنقاء لا يقل عن 99%. يمكن استخدامها في عمليات تفاعل البوليميراز المتسلسل، وRT-qPCR، وLAMP، ووضع العلامات على الحمض النووي، وتسلسل الحمض النووي.
تضمن معايير التحكم الصارمة والتكنولوجيا الحديثة أفضل جودة للمنتج. يتم اختبار كل دفعة من dNTP بحثًا عن بقايا مختلفة (الحمض النووي للبكتيريا والحمض النووي البشري وDNase وRNase وEndonuclease).المنتج مستقر من دفعة إلى أخرى ومناسب لجميع أنواع تطبيقات تخليق الحمض النووي شديدة الحساسية والقابلة للتكرار.

4. المنتجات ذات الصلة والأداء

4.1 لا يوجد بقايا الحمض النووي للبكتيريا

الشكل 1. تظهر نتائج الكشف أن dNTPs لا تحتوي على بقايا جينوم بكتيري.

4.2 لا يوجد بقايا الحمض النووي البشري

الشكل 2. تظهر نتائج الكشف أن dNTPs لا تحتوي على بقايا جينوم بشري.

4.3 لا تلوث بـ DNase وRNase وEndonuclease

الشكل 3. تظهر نتائج الكشف أن dNTPs لا تحتوي على DNase أو RNase أو Endonuclease.

4.4 تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (20 كيلو بايت من الحمض النووي)

الشكل 4. نتيجة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل هي المنتج المتوقع 20 كيلو بايت.

4.5 معلومات عن المنتجات

المنتجات التي تقدمها شركة Yeasen هي كما يلي.

الجدول 1.معلومات عن المنتجات