قيمة Ct هي تمثيل حاسم للنتائج في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري. وهي تستخدم لحساب الاختلافات في مستويات التعبير الجيني أو أعداد نسخ الجينات. إذن، ما هو نطاق قيم Ct الذي يمكن اعتباره معقولاً في القياس الكمي الفلوري؟ كيف يمكننا ضمان وقوع قيم Ct ضمن نطاق فعال؟ اليوم، دعونا نسمح لـ Xiao Yi بالإجابة على هذا السؤال للجميع.
ما هي قيمة Ct؟
في عملية تضخيم qPCR، تشير قيمة Ct إلى عدد دورات التضخيم (عتبة الدورة) التي تصل عندها إشارة الفلورسنت للمنتج المضخم إلى عتبة الفلورسنت المحددة. "C" تعني دورة، و"T" تعني عتبة. وبعبارات بسيطة، فإن قيمة Ct هي عدد الدورات التي يستغرقها القالب الأولي في qPCR للوصول إلى كمية معينة من المنتج، والتي سيتم شرحها بمزيد من التفصيل لاحقًا.
ما هي وظيفة قيمة Ct؟
1. العلاقة بين التضخيم الأسي وكمية القالب وقيمة Ct
في السيناريو المثالي، أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي، يتم تضخيم الجينات بشكل كبير وتتراكم على مدى عدد معين من الدورات. يمكن التعبير عن العلاقة بين عدد دورات التضخيم وكمية المنتج على النحو التالي: كمية المنتج المضخم = كمية القالب الأولي × (1 + En) ^ عدد الدورات. ومع ذلك، لا تحدث تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي دائمًا في ظل ظروف مثالية. عندما تصل كمية المنتج المضخم إلى "كمية منتج معينة"، فإن عدد الدورات في هذه المرحلة هو قيمة Ct، مما يشير إلى فترة التضخيم الأسي. العلاقة بين قيمة Ct وكمية القالب الأولي هي كما يلي: هناك علاقة خطية بين قيمة Ct للقالب ولوغاريتم عدد النسخ الأولية لذلك القالب. يؤدي التركيز الأعلى للقالب الأولي إلى قيمة Ct أقل، في حين يؤدي التركيز الأقل للقالب الأولي إلى قيمة Ct أعلى.
2. منحنى التضخيم، وعتبة الفلورسنت، وكمية معينة من المنتج
يتم تمثيل كمية منتجات تضخيم qPCR بشكل مباشر في شكل إشارات فلورية، والتي تُعرف باسم منحنى التضخيم. في المراحل المبكرة من PCR، عندما يكون التضخيم في ظل ظروف مثالية وعدد الدورات منخفض، يكون تراكم المنتجات ضئيلاً، ولا يمكن تمييز مستوى الفلورسنت الناتج بشكل كبير عن ضوضاء الفلورسنت الخلفية. بعد ذلك، يدخل إنتاج الفلورسنت في المرحلة الأسيّة. يمكن اكتشاف كمية منتج PCR عند نقطة معينة عندما يدخل التفاعل للتو في المرحلة الأسيّة، والتي يشار إليها باسم "كمية المنتج المعينة". يمكن استخدام هذا لاستنتاج المحتوى الأولي للقالب. لذلك، تُعرف شدة إشارة الفلورسنت المقابلة لكمية المنتج المعينة باسم عتبة الفلورسنت.
في المراحل اللاحقة من تفاعل البوليميراز المتسلسل، لم يعد منحنى التضخيم يظهر تضخيمًا أسيًا ويدخل المرحلة الخطية ومرحلة الهضبة.
3. إمكانية إعادة إنتاج قيم Ct
عندما تصل دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى عدد الدورات التي تحدث عندها قيمة Ct، فإنها تدخل للتو مرحلة التضخيم الأسي الحقيقي. في هذه المرحلة، لم يتم تضخيم الأخطاء البسيطة، لذا فإن إمكانية إعادة إنتاج قيم Ct ممتازة. وهذا يعني أنه سواء تم تضخيم نفس القالب في أوقات مختلفة أو في أنابيب مختلفة في نفس الوقت، فإن قيم Ct التي تم الحصول عليها تظل ثابتة.
ما هو نطاق قيم Ct؟
1. كفاءة التضخيم
تشير كفاءة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى الكفاءة التي يحول بها البوليميراز الجين المستهدف إلى منتجات تضخيم.تبلغ كفاءة التضخيم 100% عندما يتم تحويل جزيء DNA واحد إلى جزيئي DNA. يشار إلى كفاءة التضخيم عادةً بـ En. لتسهيل التحليل في المقالات اللاحقة، إليك مقدمة موجزة للعوامل التي تؤثر على كفاءة التضخيم.
| العوامل المؤثرة | توضيح | الأحكام |
| أ. مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل | 1. قد يحتوي قالب RNA على مواد تمنع تفاعل البوليميراز المتسلسل، مثل البروتينات أو المنظفات، وغيرها. 2. قد يحتوي cDNA الذي تم الحصول عليه بعد النسخ العكسي على تركيزات عالية من الحمض النووي الريبي القالب ومكونات كواشف النسخ العكسي، والتي قد تمنع أيضًا تفاعل البوليميراز المتسلسل اللاحق. | 1. يمكن تقييم وجود التلوث عن طريق قياس نسب A260/A280 وA260/A230 أو عن طريق إجراء التحليل الكهربائي للحمض النووي الريبي. 2. بعد النسخ العكسي، ما إذا كان يتم تخفيف cDNA بنسبة معينة. |
| ب. تصميم تمهيدي غير معقول | لا يمكن للبرايمر أن يقوم بعملية التلدين بشكل فعال. | التحقق مما إذا كانت هناك ثنائيات أو هياكل دبوس الشعر في البادئات، وما إذا كان هناك عدم تطابق؛ في بعض الأحيان يكون من الضروري الانتباه إلى التصميم الذي يمتد عبر الإنترونات. |
| ج. إجراء رد فعل غير مناسب | 1. لا يمكن للبادئات أن تقوم بعملية التلدين بشكل فعال. 2. لا يتم إطلاق نشاط بوليميراز الحمض النووي بشكل كامل. 3. بسبب ارتفاع درجات الحرارة لفترات طويلة، ينخفض نشاط بوليميراز الحمض النووي. | 1. درجة حرارة التلدين أعلى من قيمة Tm للبرايمر. 2. وقت ما قبل التحلل قصير جدًا. 3. مدة كل مرحلة في بروتوكول التفاعل طويلة جدًا. |
| د. عدم خلط الكواشف جيدًا أو أخطاء السحب | في نظام التفاعل، يكون التركيز المحلي لمكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل مرتفعًا جدًا أو غير متساوٍ، مما يؤدي إلى تضخيم غير أسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل. | / |
| طول الأمبليكون | طول الأمبليكون طويل جدًا، ويتجاوز 300 زوج قاعدي، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة التضخيم. | تحقق ما إذا كان طول الأمبليكون يتراوح بين 80 زوجًا أساسيًا و300 زوجًا أساسيًا. |
| و. تأثير كواشف qPCR | يؤدي التركيز المنخفض لبوليميراز الحمض النووي في الكواشف أو تركيزات الأيونات دون المستوى الأمثل في المحلول العازل إلى عدم وصول إنزيم Taq إلى نشاطه الأقصى. | يتم استخدام المنحنى القياسي لقياس كفاءة تضخيم البادئات. |
2. نطاق قيم Ct
يتراوح نطاق قيم Ct بين 15 و35. وتعتبر قيمة Ct الأقل من 15 ضمن المرحلة الأساسية ولم تصل إلى حد الفلورسنت. ومن الناحية المثالية، توجد علاقة خطية بين قيمة Ct ولوغاريتم عدد النسخ الأولية للقالب، والذي يُعرف باسم المنحنى القياسي. وباستخدام المنحنى القياسي، عندما تكون كفاءة التضخيم 100%، يتم حساب قيمة Ct لقياس نسخة واحدة من الجين لتكون حوالي 35. وإذا كانت قيمة Ct أكبر من 35، فمن الناحية النظرية، يكون عدد النسخ الأولية للقالب أقل من 1، وهو ما يمكن اعتباره غير ذي دلالة إحصائية.
بالنسبة للجينات المختلفة، يتطلب نطاق قيمة Ct، بسبب الاختلافات في كمية القالب الأولي لنسخ الجينات وكفاءة التضخيم، إنشاء منحنى قياسي لهذا الجين لحساب نطاق الكشف الخطي للجين.
3.العوامل المؤثرة على قيم Ct
كما هو موضح من العلاقة بين عدد دورات التضخيم وكمية المنتج: كمية منتج التضخيم = كمية القالب الأولي × (1 + En)^عدد الدورات، يمكن ملاحظة أنه في ظل الظروف المثالية، فإن كمية القالب الأولي وEn ستؤثر على قيمة Ct. يمكن أن تتسبب الاختلافات في جودة القالب أو كفاءة التضخيم في أن تكون قيمة Ct مرتفعة للغاية أو منخفضة للغاية.
4. قيم Ct مرتفعة جدًا أو منخفضة جدًا
قام شياو يي باستشارة الخبراء في القسم الفني بشركتنا وقام بتلخيص الأسباب والحلول لنوعي المشاكل الشائعة مع قيم Ct لتثقيف قرائنا.
| مشكلة | الأسباب | الحلول |
| قيمة Ct مرتفعة جدًا | تركيز القالب منخفض أو توجد مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل. كفاءة التضخيم منخفضة. | 1. زيادة تركيز القالب؛ أو زيادة نسبة تخفيف الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي التكميلي؛ أو تحضير القالب مرة أخرى. 2. قم بخفض درجة حرارة التلدين، أو استخدم طريقة التضخيم المكونة من خطوتين؛ وتأكد من خلط المكونات والنظام جيدًا؛ وقم بتحسين بروتوكول التفاعل؛ أو حاول استبدال الكواشف. |
| قيمة Ct منخفضة جدًا | 1. تركيز القالب العالي 2. التلوث في NTC (عدم وجود تحكم بالقالب) وNRC (عدم وجود تحكم عكسي) 3. تصميم غير مناسب للطبقة التمهيدية | 1. تقليل كمية الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (RNA) أو تخفيف الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (cDNA) بنسبة أعلى. 2. استبدل جميع الكواشف من جديد؛ أو استخدم كواشف UDGase المضادة للتلوث. 3. تحسين الإجراء لتجنب التضخيم غير المحدد. |
وبهذا نختتم تحليل أسباب قيمة Ct غير الطبيعية لهذه المشكلة. بعد ذلك، سيوصي شياو يي بمجموعة من المنتجات الفعالة من حيث التكلفة لضمان دقة وموثوقية بياناتك التجريبية. تعال واختر المنتجات المفضلة لديك!
| اسم المنتج | قطة# | مقاس |
| مزيج Hieff UNICON™ Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix | 11184ES08 | 5×1 مل |
| Hifair™ 3 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix لـ qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES60 | 100 طن |
| Hifair™ AdvanceFast One-step RT-gDNA Digestion SuperMix لـ qPCR | 11151ES60 | 100 طن |
| مجموعة تركيب الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين Hifair™ AdvanceFast 1st Strand (بدون صبغة) | 11150ES60 | 100 طن |