إن تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري (qPCR) هي تقنية شائعة الاستخدام في المختبرات، ويمكن تطبيقها على تحليل التعبير الجيني، وتحديد النمط الجيني، واكتشاف مسببات الأمراض، وتحليل SNP، والمزيد. إن تشغيل تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بسيط، ومبدأها سهل الفهم. والآن، في مواجهة كومة من البيانات الفوضوية، تصبح كيفية تحليل النتائج مهمة شاقة. اليوم، سوف يرشدك شياو يي حول كيفية تبسيط العمليات المعقدة والحصول بسهولة على البيانات التي يمكن نشرها في مجلات SCI!
تتضمن طرق التحليل الشائعة المستخدمة في qPCR القياس الكمي النسبي والقياس الكمي المطلق، ويجب أن يعتمد الاختيار بين هذه الطرق على تصميمات تجريبية مختلفة. في هذا العدد، سنركز على تطبيق شائع لـ qPCR وهو تحليل التعبير الجيني، حيث يتم اختيار طريقة القياس الكمي النسبي بشكل عام.
التصميم التجريبي
لنفترض أننا نحتاج حاليًا إلى دراسة تأثير الحث الضوئي على التعبير عن جين AtSUC2 في نبات أرابيدوبسيس. ستتكون المجموعة الضابطة من نباتات أرابيدوبسيس التي لم تخضع لأي علاج، في حين ستتكون المجموعة التجريبية من نباتات عولجت بتحريض ضوئي معين. سيتم استخراج الحمض النووي الريبي من كلتا المجموعتين ونسخه عكسيًا للحصول على الحمض النووي الريبي التكميلي، والذي سيتم استخدامه بعد ذلك كقالب. سيتم اختيار جين GAPDH في نبات أرابيدوبسيس كمرجع داخلي لتجربة qPCR.
الآبار qPCR التي تحتاج إلى الإعداد هي كما يلي:
1) مركز التحكم الوطني (لا يوجد قالب للتحكم) يستخدم للتحقق من وجود تلوث في نظام PCR.
2) العلاج ببدائل النيكوتين (عدم النسخ العكسي) يشير إلى استخدام الحمض النووي الريبي الذي لم يخضع للنسخ العكسي كقالب، والذي يعمل بمثابة عنصر تحكم لتلوث الحمض النووي الريبي الجيني.
3) ال جين مرجعي داخلي يتم استخدامه لتصحيح الاختلافات الناجمة عن اختلاف تركيزات العينات الأولية.
4) اختيار عينات التحكم تندرج عمومًا ضمن الفئات التالية:
- لتقييم تأثير علاج معين على التعبير الجيني، يتم استخدام العينة غير المعالجة كعينة مرجعية.
- لكشف الاختلافات في التعبير الجيني في أوقات مختلفة، يتم استخدام العينة في الوقت 0 كعينة مرجعية.
- لمقارنة الاختلافات في التعبير الجيني بين الأنسجة المختلفة، يتم اختيار نسيج واحد بشكل تعسفي كعينة مرجعية.
هناك نقطة يجب ملاحظتها هنا وهي أنه بالنسبة لكل مادة مذكورة أعلاه، تم إنشاء 3 آبار تفاعل البوليميراز المتسلسل (1، 2، 3). هذه هي نسخ مكررة من تفاعل البوليميراز المتسلسل، والمعروفة أيضًا باسم النسخ الفنية، والتي تهدف إلى القضاء على الأخطاء التشغيلية وتقييم كفاءة التضخيم بدقة. بالإضافة إلى ذلك، يجب إنشاء نسخ بيولوجية مكررة، والتي تنطوي على إجراء نفس التجربة على مواد مختلفة (أوقات مختلفة، نباتات، دفعات، لوحات تفاعل) لمعايرة التباين البيولوجي وتحليل ما إذا كان العلاج له أهمية إحصائية. على وجه التحديد في هذه الحالة، تتطلب كل من المجموعة التجريبية ومجموعة التحكم معالجة مجموعتين إضافيتين على الأقل من عينات نبات أرابيدوبسيس (أ، ب، ج). يتم استخراج الحمض النووي الريبي من كل مجموعة ونسخه عكسيًا، متبوعًا بتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. للتحليل الإحصائي، يتم استخدام متوسط النسخ البيولوجية الثلاثة.
تحليل النتائج - طريقة ΔΔCt
تتميز طريقة ΔΔCt بأنها تعتمد فقط على قيم Ct للحساب، ولكن الفرضية هي أن كفاءة التضخيم للجين المستهدف والجين المرجعي يجب أن تكون متسقة نسبيًا وكلاهما يقع ضمن نطاق 90-110%.
صيغة الحساب المحددة هي كما يلي:
ΔCt = Ct (الجين المستهدف) - Ct (الجين المرجعي)
ΔΔCt = ΔCt (المجموعة التجريبية) - ΔCt (مجموعة التحكم)
RQ = 2^(-ΔΔCt)
بافتراض إجراء التجربة المذكورة أعلاه لدراسة تأثير تحريض الضوء على التعبير عن جين AtSUC2 في نبات أرابيدوبسيس، فإن نتائج qPCR هي كما يلي:
أثناء الحساب، نحسب أولاً متوسط بيانات 2^-△Ct للمجموعة الضابطة (كما هو موضح في الشكل أعلاه، وهو 0.00116). ثم نقسم كل قيمة من 2^-△Ct على هذا المتوسط للحصول على قيمة 2^-△△Ct. وأخيرًا، ننظم هذه القيم للحصول على المتوسط والانحراف المعياري، مما يشير إلى أن مستوى التعبير عن الجين المستهدف في المجموعة التجريبية زاد بنحو 9.73 ضعفًا مقارنة بالمجموعة الضابطة.
يتم رسم النتائج باستخدام برنامج Graphpad على النحو التالي:
قيمة P المحسوبة باستخدام اختبار t للبرنامج هي 0.0024، وهي أقل من 0.05، مما يشير إلى وجود فرق ذي دلالة إحصائية والنتائج موثوقة.
تحليل النتائج - طريقة المنحنى القياسي المزدوج
في التطبيقات العملية، نظرًا لأن كفاءة التضخيم للجين المستهدف والجين المرجعي غالبًا ما تكون مختلفة، فمن الضروري إعادة تصميم البادئات وتحسين ظروف التفاعل لتحقيق نفس كفاءة التضخيم. ومع ذلك، يمكننا أيضًا اختيار طريقة أكثر ملاءمة، وهي نهج المنحنى ذي المعيار المزدوج.
هنا، دعونا أولاً نفهم طريقة تحليل التقدير المطلق. الخطوات المحددة هي تضخيم القطعة المستهدفة من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل، ثم إدخال القطعة المستهدفة في متجه استنساخ، واستخراج البلازميد المؤتلف، وبعد تأكيد التسلسل أنه صحيح، يمكن استخدامه كمعيار. يمكن قياس كمية الحمض النووي البلازميدي باستخدام أدوات مثل Nanodrop، ويتم تحويل عدد النسخ إلى نسخ بلازميدية محددة باستخدام صيغة تحويل عدد النسخ. بعد ذلك، يتم تضخيم الحمض النووي بعد سلسلة من التخفيفات. يتم رسم منحنى قياسي مع لوغاريتم عدد النسخ القياسي كمحور x وقيم Ct المقاسة كمحور y. بناءً على قيمة Ct للعينة غير المعروفة، يمكن حساب عدد نسخها المطلق.
صيغة حساب عدد النسخ:
عدد النسخ = (الكتلة ÷ الكتلة الجزيئية النسبية) × 6.02 × 10^23
تتضمن طريقة المنحنى القياسي المزدوج إنشاء عينات قياسية منفصلة للجين المستهدف والجين المرجعي، وإجراء تقدير كمي مطلق، وإنشاء منحنيات قياسية. بعد حساب عدد النسخ المطلق للعينات غير المعروفة، يتم إجراء مقارنة، وبالتالي تقديم دقة أعلى.
صيغة الحساب المحددة هي كما يلي:
س = عدد نسخ الجينات المستهدفة / عدد نسخ الجينات المرجعية
RQ = Q (تجريبي) / Q (ضابط)
في التجربة المذكورة أعلاه، والتي تبحث في تأثير تحريض الضوء على التعبير عن جين AtSUC2 في نبات أرابيدوبسيس، تم إنشاء عينات قياسية لكل من AtSUC2 وGAPDH، وتم إعداد المنحنيات القياسية التالية:
قيم Ct للجين المستهدف والجين المرجعي الداخلي في العينات المراد اختبارها هي كما يلي:
أثناء الحساب، يتم أولاً استبدال قيم Ct للجين المستهدف والجين المرجعي الداخلي في العلاقة الخطية للمنحنى القياسي للحصول على أعداد النسخ المطلقة للجين المستهدف والجين المرجعي الداخلي في كل من المجموعتين التجريبية والضابطة. بعد ذلك، باستخدام الصيغة Q = عدد نسخ الجين المستهدف / عدد نسخ الجين المرجعي، يتم تطبيع مستوى التعبير للجين المستهدف.وأخيرا، وفقا للصيغة RQ = Q (تجريبي) / Q (ضابط)، تم حساب RQ ليكون 9.71، مما يشير إلى أن مستوى التعبير عن الجين المستهدف في المجموعة التجريبية أعلى بمقدار 9.71 مرة من ذلك الموجود في مجموعة التحكم.
يتم رسم النتائج باستخدام برنامج GraphPad على النحو التالي:
القيمة P المحسوبة باستخدام اختبار t للبرنامج هي 0.0008، وهي أقل من 0.05، مما يشير إلى وجود فرق ذي دلالة إحصائية والنتائج موثوقة.
وبهذا نختتم تحليل بيانات qPCR لهذه الجلسة. بعد ذلك، سأوصي بمجموعة من المنتجات ذات التكلفة الفعالة لضمان دقة وموثوقية بياناتك التجريبية. تعال واحصل عليها!
| اسم المنتج | قطة# | مقاس |
| مزيج Hieff UNICON™ Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix | 11184ES08 | 5×1 مل |
| Hifair™ 3 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix لـ qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES60 | 100 طن |
| Hifair™ AdvanceFast One-step RT-gDNA Digestion SuperMix لـ qPCR | 11151ES60 | 100 طن |
| مجموعة تركيب الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين Hifair™ AdvanceFast 1st Strand (بدون صبغة) | 11150ES60 | 100 طن |