يبلغ طول miRNA الناضج حوالي 20nt فقط، وعادةً ما يغطي البادئ الأمامي طوله بالكامل أو حتى يحتوي على جزء زائد، ولن يكون للبادئ العكسي مكان يوضع فيه. الحل الحالي للسوق هو زيادة طول النسخة العكسية أثناء النسخ العكسي. تشمل الطرق الشائعة طريقة الذيل وطريقة حلقة الجذع.

1. المقدمة
2. المنتجات الموصى بها
3. قائمة المنتجات ذات الصلة

1. المقدمة

microRNAs (miRNAs) هي RNAs صغيرة أحادية السلسلة بحجم حوالي 21-23 قاعدة، والتي يتم إنشاؤها من سلائف RNA أحادية السلسلة ذات بنية دبوس الشعر من حوالي 70-90 قاعدة بعد معالجة إنزيم Dicer. ترتبط miRNA بشكل أساسي بمنطقة غير مشفرة في الطرف 3' من mRNA الجين المستهدف، وتنظم عملية ترجمة mRNA الجين المستهدف بعد النسخ، وبالتالي تمنع ترجمة mRNA وتعزز تحلل mRNA، مما يؤدي إلى انخفاض التعبير البروتيني. يشارك دور miRNAs في حدوث وتطور أمراض القلب والأوعية الدموية المختلفة مثل التطور الجيني، وتمايز الأنسجة، وتكاثر الخلايا، وموت الخلايا المبرمج.

الشكل 1. مخطط تخطيطي لتخليق miRNA في الجسم الحي

يبلغ طول miRNA الناضج حوالي 20nt فقط، وعادةً ما يغطي البادئ الأمامي طوله بالكامل أو حتى يحتوي على جزء زائد، ولن يكون للبادئ العكسي مكان يوضع فيه. الحل الحالي للسوق هو زيادة طول النسخة العكسية أثناء النسخ العكسي. تشمل الطرق الشائعة طريقة الذيل وطريقة حلقة الجذع.

الشكل 2. تخليق miRNA بطريقة الذيل

الشكل 3. تخليق miRNA بطريقة حلقة الجذع

تستخدم طريقة الذيل بوليميراز بولي أ لإضافة ذيل بولي (أ) إلى miRNA الناضج وتستخدم أوليجو-دي تي مع التسلسل العالمي كتمهيد للنسخ العكسي لتوليف miRNA المطول المقابل للسلسلة الأولى من cDNA. تستخدم طريقة حلقة الجذع التسلسل العالمي المطوي في بنية حلقة الجذع كتمهيد لتوليف السلسلة الأولى من cDNA المقابلة لـ miRNA المطول. سيتم فتح بنية حلقة الجذع عند درجة حرارة مناسبة أثناء عملية التضخيم اللاحقة ويتم دمجها مع التمهيدات التضخيمية ذات الصلة.

الجدول 1.مقارنة بين الذيل والحلقة الجذعية

2. المنتجات الموصى بها

2.1 مجموعة عكس الذيل الكمي لـ Yeasen miRNA (11148ES&11171ES)

الشكل 4. مجموعة تصنيع cDNA من السلسلة الأولى من miRNA 11148ES-Hifair™

تتبنى المجموعة طريقة الذيل لعكس نسخ cDNA من السلسلة الأولى من miRNA. يحتوي عازل RT miRNA 2×Hifair™ في المنتج على جميع المواد الخام والبادئات لتفاعل الذيل وتفاعل النسخ العكسي لـ miRNA، وقد تم تحسينه بعناية. يمكنه ضمان تنفيذ عمليات تعديل poly(A) والنسخ العكسي لنهاية miRNA 3' بكفاءة في وقت واحد.

الشكل 5. 11171ES -Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

جيل جديد من كواشف الكشف الكمي عن تفاعل البوليميراز المتسلسل الفلورسنتي الممزوج مسبقًا والمطورة خصيصًا للكشف الكمي عن miRNA، تحتوي على صبغة مرجعية سلبية ROX خاصة، ومناسبة لجميع أجهزة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي، ولا حاجة لضبط تركيز ROX على أجهزة مختلفة، فقط في تفاعل التحضير يمكن إجراء التضخيم عن طريق إضافة برايمرات وقوالب إلى النظام. يعتمد بوليميراز الحمض النووي على بوليميراز البدء الساخن المعدل كيميائيًا، ويتعاون مع نظام عازل خاص، مما يجعل خصوصية التفاعل وحساسيته أعلى، ويمكنه تحديد الكم بدقة في نطاق أوسع.

2.2 أداء المنتج

2.2.1 متوافق مع جميع أجهزة qPCR

الشكل 6. النتائج المتوافقة مع أجهزة qPCR المختلفة

باستخدام إجمالي الحمض النووي الريبي لخلايا 293T كقالب، تم إجراء النسخ العكسي باستخدام مجموعة توليف cDNA من السلسلة الأولى من miRNA من Hifair™ (رقم القطعة 11148ES).تم تخفيف cDNA الناتج بمقدار 10 أضعاف، ثم تم استخدام Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) للكشف عن الجينات المرجعية الداخلية لـ hsa-miR-let-7b-5p، وhsa-miR-let-7c-5p، وU6، على التوالي.

2.2.2 معدل اكتشاف مرتفع يصل إلى 10 بيكو جرام

الشكل 7. مخطط التضخيم

الشكل 8. مخطط التضخيم

باستخدام hsa-miR-let-7e-5p(a) الاصطناعي و293T cell Total RNA(b) كقوالب، تم تخفيفها إلى التدرجات التالية على التوالي: 60 نسخة إلى 606 نسخة (6 تدرجات) و10 pg-100 ng (5 تدرجات)، تم النسخ العكسي باستخدام Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)، وتم الكشف عن cDNA الناتج باستخدام Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) للتعبير عن جين hsa-miR-let-7e -5p.

2.2.3 خصوصية عالية، قادرة على التمييز بين الاختلافات القاعدية الفردية بين miRNAs في نفس العائلة

الشكل 9. التمييز بين الاختلافات في القاعدة الفردية بين miRNAs

تحتوي عائلة hsa-let-7 البشرية على العديد من miRNAs، مع وجود عدد قليل من القواعد التي تختلف عن بعضها البعض، أو حتى اختلاف قاعدة واحدة فقط. تم نسخ miRNAs الاصطناعية لكل شكل من أشكال Let-7 (hsa-miR-let-7a~Let-7i, has-miR-98) عكسيًا إلى cDNA باستخدام مجموعة Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)، باستخدام Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) لتضخيم هذه miRNAs بشكل منفصل باستخدام بادئات مختلفة، وحساب معدل المطابقة باستخدام المعادلة 2-ΔCT x 100%. تُظهر النتائج أنه يمكن التمييز بشكل فعال بين أفراد عائلة النوع الفرعي وثيقة الصلة.

2.2.4 كفاءة تضخيم ممتازة

الشكل 10. كفاءة التضخيم

الشكل 11. كفاءة التضخيم

تم تضخيم جينات miR-let-7b-5p وmiR-let-7c-5p وmiR-let-7e-5p وmiR-let-7f-5p باستخدام خلايا 293T البشرية وإجمالي الحمض النووي الريبي من كبد الفأر كقوالب. أظهرت النتائج أنه بالمقارنة مع المنتجات المماثلة، فإن مجموعة تركيب cDNA من Hifair™ miRNA 1st Strand (رقم الصنف 11148ES) تطابق نظام التفاعل الخاص بمزيج Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (رقم الصنف 11171ES) بأداء ممتاز.

2.2.5 استقرار ممتاز

الشكل 12. تحليل استقرار المنتج عند 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام

الشكل 13. تحليل النتائج بعد 50 دورة تجميد وذوبان

الشكل 14. الخصائص التحليلية المستقرة لنظام التفاعل الكمي عند درجات حرارة مختلفة لمدة 24 ساعة

تم إجراء النسخ العكسي باستخدام مجموعة تخليق cDNA من سلسلة miRNA الأولى من Hifair™ (رقم القطعة 11148ES) باستخدام إجمالي RNA لخلايا 293T كقالب، وتم تخفيف cDNA الناتج بمقدار 10 أضعاف وتم الكشف عنه باستخدام Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (رقم القطعة 11171ES). التعبير عن hsa-miR-let-7b-5p وhsa-miR-let-7c-5p وhsa-miR-let-7e-5p. △Ct<0.5.

2.3 تركيبة عكسية كمية لجزيئات الجذع والحلقة من جزيء Yeasen miRNA (11139ES&11170ES)

الشكل 15. مجموعة تصنيع cDNA من السلسلة الأولى 11139ES-Hifair™ III (جهاز هضم gDNA بالإضافة إلى ذلك)

تم تطوير المجموعة على أساس Hifair™ III Reverse Transcriptase.سرعة تخليق cDNA للإنزيم سريعة، كما تم تحسين الاستقرار الحراري بشكل كبير. وفي الوقت نفسه، يعزز الإنزيم التقارب مع القالب وهو مناسب للنسخ العكسي لكمية صغيرة من القوالب والجينات ذات النسخ المنخفضة. كما تم تحسين قدرة Hifair™ III Reverse Transcriptase على تخليق cDNA كامل الطول، مما يسمح بتخليق cDNA حتى 19.8 كيلو بايت.

الشكل 16. 11170ES-Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

هذا المنتج عبارة عن مزيج رئيسي خاص لقياس كمية miRNA باستخدام طريقة الفلوريسنت الكيميري SYBR Green I. نظرًا لأن تسلسلات miRNA قصيرة وغالبًا ما تكون تسلسلات miRNA في نفس العائلة متشابهة للغاية، فإن الخصوصية مطلوبة بشدة أثناء القياس. يعتمد هذا المنتج على بوليميراز الحمض النووي الساخن، مع المخزن المؤقت المحسن، والذي يمكن أن يقلل بشكل كبير من التضخيم غير النوعي؛ في نفس الوقت، تجعل صبغة ROX المرجعية الخاصة المزيج الرئيسي مناسبًا لجميع أجهزة qPCR، ولا توجد حاجة لضبط ROX على أجهزة مختلفة. يمكن إجراء التضخيم عن طريق إضافة برايمرات وقوالب عند تحضير نظام التفاعل.

2.3.1 متوافق مع جميع أجهزة qPCR

الشكل 17. نتائج متوافقة مع أجهزة qPCR المختلفة

باستخدام إجمالي الحمض النووي الريبوزي لخلايا الكبد لدى الفئران كقالب، تم إجراء النسخ العكسي باستخدام Hifair™ III 1st Strand
تم استخدام مجموعة تخليق cDNA (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES)، وتم تخفيف cDNA الناتج بمقدار 40 ضعفًا واستخدام Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES) لتضخيم جين mmu-miR-125a البشري، على التوالي.

2.3.2 حساسية عالية تصل إلى 10 بيكو جرام

الشكل 18. كشف الحساسية

باستخدام إجمالي الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين لخلايا كبد الفأر كقالب، تم إجراء النسخ العكسي باستخدام مجموعة تخليق الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين من النوع Hifair™ III 1st Strand (gDNA digester plus) (رقم القطعة 11139ES)، وتم تخفيف الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الناتج بشكل تسلسلي بمقدار 10 أضعاف (نطاق 10 بيكو جرام/ميكرولتر). -0.1 ميكروجرام/ميكرولتر)، وتضخيم الجينات mmu-miR-125a وmmu-miR-132 وmmu-miR-351 ذات الأصل الفأري.

2.3.3 خصوصية عالية، قادرة على التمييز بين الاختلافات القاعدية الفردية بين miRNAs في نفس العائلة

الشكل 19. التمييز بين الاختلافات في القاعدة الفردية بين miRNAs

تحتوي عائلة hsa-let-7 البشرية على العديد من miRNAs، مع وجود عدد قليل من القواعد التي تختلف عن بعضها البعض، أو حتى اختلاف قاعدة واحدة فقط. تم تضخيم هذه miRNAs بشكل منفصل باستخدام برايمرات مختلفة باستخدام Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES)، وتم حساب معدل المطابقة باستخدام الصيغة 2^-Δct x 100%.

2.3.4 القدرة على التكرار الجيد

الشكل 20. اكتشاف القدرة على التكرار

باستخدام إجمالي الحمض النووي الريبي لخلايا 293T البشرية كقالب للنسخ العكسي، تم إجراء النسخ العكسي باستخدام مجموعة تخليق cDNA من السلسلة الأولى Hifair™ III (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES)، وتم تخفيف cDNA الناتج بمقدار 50 ضعفًا واستخدام Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES) لتضخيم جين hsa-let-7a البشري في تجربة تكرار 90 بئرًا.

2.3.5 استقرار جيد

الشكل 21.تحليل استقرار 11170ES عند درجات حرارة مختلفة لمدة 14 يومًا

الشكل 22. تحليل التجميد والذوبان المتكرر لـ 11170ES

الشكل 23. خصائص التحليل المستقرة لنظام التفاعل الكمي عند درجات حرارة مختلفة لمدة 24 ساعة

تم استخدام الحمض النووي الريبي الكلي لخلايا كبد الفأر كقالب للنسخ العكسي باستخدام مجموعة تخليق الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين Hifair™ III 1st Strand (gDNA digester plus) (رقم الصنف 11139ES). تم تخفيف الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين الناتج بمقدار 100 ضعف لتضخيم جين mmu-miR-132 الفأري.

3. قائمة المنتجات ذات الصلة

تأسست شركة Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. في عام 2014، وهي شركة ذات تكنولوجيا عالية تعمل في مجال البحث والتطوير وإنتاج المواد الخام للإنزيمات والأجسام المضادة للمستضدات. تشمل منتجاتها الإنزيمات التشخيصية الجزيئية والبروتينات والأجسام المضادة المستخدمة في الصناعات الدوائية واختبار سلامة الأغذية والتربية والعدالة وغيرها من الصناعات. نحن ملتزمون بتزويد العملاء في مجال علوم الحياة بمنتجات وخدمات عالية الجودة. المنتجات ذات الصلة التي تقدمها Yeasen هي كما يلي:

الجدول 2. قائمة المنتجات ذات الصلة