إنجاز مذهل من ياسين والتكنولوجيا الحيوية لمولفيوتشر
مع التطور السريع للتكنولوجيا الحيوية، اجتذب علاج mRNA، كطريقة علاج ناشئة، الكثير من الاهتمام بسبب قابليته القوية للبرمجة وسرعة الاستجابة السريعة. في مجالات مثل لقاحات mRNA والعلاج الجيني، يعد التخليق الفعال لـ mRNA عالي الجودة خطوة حاسمة في تحقيق الأهداف العلاجية. في هذه العملية، يلعب بوليميراز T7 RNA دورًا حاسمًا، حيث يمكنه تحفيز تخليق mRNA في المختبر بكفاءة.
قضية المنتج الثانوي لـ dsRNA من بوليميراز T7 RNA
على الرغم من أن بوليميراز RNA T7 يلعب دورًا مهمًا في تخليق mRNA، فإن العملية الفعلية غالبًا ما تؤدي إلى إنتاج RNA مزدوج السلسلة (dsRNA) كمنتج ثانوي. لا يؤدي وجود dsRNA إلى تقليل إنتاج ونقاء mRNA فحسب، بل قد يؤدي أيضًا إلى تحفيز استجابات مناعية غير محددة، مما يؤثر على الفعالية والسلامة. لذلك، أصبح تقليل إنتاج dsRNA حاجة ملحة في الصناعة. حاليًا، تتضمن طرق تقليل إنتاج dsRNA بشكل أساسي تحسين ظروف التفاعل واستخدام الإنزيمات المساعدة. وعلى الرغم من أن هذه الطرق يمكن أن تقلل إنتاج dsRNA إلى حد ما، إلا أنها غالبًا ما تأتي مع مشكلات مثل التشغيل المعقد وزيادة التكاليف.
لماذا يجب علينا القيام بهندسة بوليميراز T7 RNA؟
إن تعديل بوليميراز T7 RNA بشكل مباشر لتقليل إنتاج dsRNA هو حل أكثر جوهرية. يمكن لتقنيات التطور الموجه بالإنزيم تحسين خصائصه التحفيزية وزيادة نقاء وإنتاجية المنتجات من خلال تغيير تسلسل الأحماض الأمينية أو هيكل الإنزيم بدقة. بالنسبة لبوليميراز T7 RNA، لا يمكن للتعديل المستهدف تقليل إنتاج dsRNA فحسب، بل يعزز أيضًا الكفاءة والجودة الإجمالية لتخليق mRNA.
باعتبارها موردًا للمواد الخام لتخليق mRNA في المختبر، فإن Yeasen التكنولوجيا الحيوية، و شركتها التابعة Molefuture التكنولوجيا الحيوية يملك لقد طور فريق التطوير بوليميراز RNA T7 جديد باستخدام منصة التطور الموجهة ZymeEditor. ومن أجل تقليل إنتاج المنتجات الثانوية مثل dsRNA أثناء عمليات النسخ في المختبر، قام فريق التطور بتصميم بوليميراز RNA T7 من خلال الجمع بين التصميم العقلاني والفحص الموجه.
كيف يتم توليد dsRNA؟
وفقًا لتقارير الأدبيات، فإن إنتاج منتج dsRNA الثانوي ينشأ بشكل أساسي من مصدرين (الشكل 1): الأول هو أثناء انتقال بوليميراز RNA T7 من تكوين البدء إلى تكوين الاستطالة في المراحل المبكرة من النسخ، يكون معقد النسخ الثلاثي عرضة للتفكك [1]، مما يؤدي إلى إطلاق عدد كبير من سلاسل RNA القصيرة (RNA الإجهاضي) بأطوال حوالي 20 nt في النظام. تعمل سلاسل RNA هذه كـ "بادئات"، اقتران تكميلي مع سلاسل RNA الطويلة، وتمتد لإنتاج dsRNA تحت تأثير نشاط بوليميراز RNA المعتمد على RNA لبوليميراز RNA T7 (نشاط RDRP) [2،3]. يتم تشغيل المصدر الثاني من خلال نشاط نقل الريبونوكليوتيد الطرفي الذي تمتلكه بوليميراز RNA T7. عندما يصل تفاعل النسخ إلى نهاية القالب الخطي، قد تضيف بوليميراز RNA T7 عشوائيًا العديد من الريبونوكليوتيدات دون الاعتماد على القالب. قد تطوي هذه النيوكليوتيدات الريبونوكليوتيدات، التي تشكل "بادئات عشوائية"، عكسيًا وترتبط بشكل تكميلي بمنطقة mRNA المستهدفة، وتمتد لإنتاج dsRNA. يُطلق على dsRNA الناتج عن التكرار اسم loopback dsRNA [3،4]. لذلك، من أجل تقليل المنتجات الثانوية لـ dsRNA، فإن التركيز في تعديل بوليميراز RNA T7 يكمن في تثبيت المجمع الثلاثي للنسخ المبكر أو إضعاف نشاط النقل الطرفي وبوليميراز RNA المعتمد على RNA (RDRP) نشاط بوليميراز T7 RNA.
الشكل 1. مخطط تخطيطي لحاجز الطاقة ومبدأ تكوين dsRNA (بيانات غير منشورة)
كيفية التغلب عليها حاجز الطاقة من بوليميراز الحمض النووي الريبوزي T7 الانتقال التكويني؟
ومن خلال التحليل البنيوي وتحليل الطاقة الحرة، اكتشف الفريق من ناحية أنه إلى جانب التغيرات التكوينية لبوليميراز الحمض النووي الريبي T7، هناك أيضًا تغير في الطاقة. الطاقة الحرة لتكوين الاستطالة أعلى بشكل ملحوظ من تلك الخاصة بتكوين البدء، مما يشير إلى أن عملية النسخ تحتاج إلى التغلب على حاجز طاقة أعلى لإنتاج سلاسل mRNA كاملة. حاجز الطاقة العالية غير مواتٍ للانتقال التكويني السلس. لذلك، استخدم الفريق عاقِل طرق الفحص لتحديد أكثر من 20 حمض أميني ساخن وإنشاء مكتبات الطفرات المشبعة المقابلة.
كيفية تعديل نقل الطرف وأنشطة RDRP لبوليميراز RNA T7
من ناحية أخرى، ونظرًا للتقارير المحدودة عن الوظائف والمواقع والمجالات البنيوية المتعلقة بنقل الطرف وأنشطة RDRP لبوليميراز T7 RNA، ولأن هذين النشاطين، المتشابهين وظيفيًا، من المحتمل أن يشتركا في مواقع رئيسية مع التفاعل الرئيسي لبوليميراز T7 RNA - نشاط النسخ (أي نشاط بلمرة RNA المعتمد على الحمض النووي، DDRP) - فمن الصعب العثور على أحماض أمينية ساخنة للتعديل الموجه للموقع. لذلك، قام الفريق في وقت واحد ببناء العديد من مكتبات الطفرات العشوائية بناءً على تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ، جنبًا إلى جنب مع قدرة التطور عالية الإنتاجية لمنصة ZymeEditor، مما أدى إلى تنوع يتجاوز 10 ^ 6 لكل مكتبة فردية.
اكتشاف المثالي عن طريق المسبار بوليميراز الحمض النووي الريبوزي T7
لتحقيق التوازن في إنتاج بوليميراز RNA T7 ومراقبة محتوى dsRNA في تفاعل النسخ في المختبر، قام الفريق، بالإشارة إلى قوالب النسخ المحسّنة، بتصميم العديد من الفلورسنت بعناية يتم استخدام مجسات تستهدف مناطق مختلفة من منتجات mRNA المستهدفة. تربط هذه المجسات معلومات مثل العائد التفاعلي والسلامة ومحتوى dsRNA داخل النظام بإشارات الفلورسنت. كلما زادت شدة الفلورسنت في النظام، كلما كان أداء الطفرة أكثر فائدة. من الناحية النظرية، يمكن لطريقة الفحص هذه تصنيف الطفرات بناءً على شدة الفلورسنت للمجسات المختلفة، والحصول على طفرات بوليميراز RNA T7 ذات العائد العالي أو RNA الإجهاضي المنخفض، بالإضافة إلى الطفرات ذات النزاهة المحسنة أو dsRNA الحلقة المرتدة المخفضة. عندما يتم استبدال قالب التفاعل بـ RNA، يمكن أيضًا فحص الطفرات ذات نشاط RDRP المنخفض بشكل سلبي، مما يحسن انتقائية قالب بوليميراز RNA T7. بالإضافة إلى ذلك، من خلال إضافة نيوكليوتيدات معدلة، ونظائر الغطاء، وزيادة درجة حرارة التفاعل في نظام تفاعل القطرات، يمكن إجراء فحص إضافي لاختيار طفرات بوليميراز RNA T7 التي تتسامح مع الركائز غير الطبيعية وتظهر استقرارًا حراريًا محسنًا.
كيفية الفحص بشكل أفضل بوليميراز الحمض النووي الريبوزي T7؟
بناءً على حجم المكتبات، الفريق تم تطوير عمليات فحص عالية الإنتاجية للغاية تعتمد على فرز القطرات المنشطة بالفلورسنت (FADS) وعمليات فحص عالية الإنتاجية تعتمد على طرق اللوحة الدقيقة التقليدية (MTPS).من خلال جولات متعددة من التجارب، تم فحص أكثر من 10^7 طفرة في المجموع، مما أدى إلى ظهور طفرات متعددة ذات محتوى منخفض بشكل كبير من dsRNA. ومن بينها، أظهرت بعض الطفرات انخفاضًا في dsRNA بسبب Abortive RNA في التفاعل، مما يشير إلى أن تكوين الاستطالة لهذه الطفرات البوليميرازية أكثر استقرارًا. أظهرت بعض الطفرات انخفاضًا في محتوى dsRNA في الحلقة الراجعة في التفاعل، مما يشير إلى ضعف نشاط النقل الطرفي أو نشاط RDRP في هذه الطفرات.
ونظرًا لأن مزايا الأداء للطفرات المذكورة أعلاه تنبع من آليات مختلفة، فإن الفريق قام الفريق بإنشاء مكتبات خلط الحمض النووي التي تستهدفهم. بعد الفحص، تم الحصول أخيرًا على طفرات ذات أداء متفوق مع إنتاج منخفض للغاية من dsRNA دون التأثير على العائدات وسلامة mRNA (الشكل 2). ومع ذلك، تأثرت عائدات الطفرة G47A+884G التي اكتشفتها شركة Moderna[5] (غير منشور).
الشكل 2. عملية تطور الإنزيم وتوصيف أداء الطفرات
(غير منشور)
تحليل توليد dsRNA بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبوزي T7 المتغيرات؟
بعد التحليل الكمي، كما هو موضح في الشكل 3، باستخدام قالب نسخ بحجم 9 كيلو بايت في ظل ظروف تغطية النسخ المشترك، أنتجت بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 من النوع البري ما يقرب من 2.9 نانوجرام/ميكروجرام من الحمض النووي الريبي ثنائي الترابط عند استخدام النيوكليوتيدات الطبيعية، في حين أنتجت بوليميراز الحمض النووي الريبي التجاري أنزيم T7 أنتجت حوالي 0.18 نانوجرام/ميكروجرام من dsRNA. ومع ذلك، فإن إنتاج dsRNA لكل متغير من بوليميراز RNA T7 تم بناء أقل من 0.10 نانوجرام/ميكروجرام. على وجه الخصوص، واحد متغير كان 0.015 نانوجرام/ميكروجرام فقط، أي أقل بنحو 200 مرة من النوع البري وأقل بنحو 12 مرة من النوع التجاري. المنتج. بعد الاختبار المتكرر، لوحظت ميزة الأداء للمتغيرات في تقليل dsRNA باستمرار في ظل ظروف تفاعل مختلفة، مما يشير إلى توافق جيد بين النظام لهذه الطفرات ووضع الأساس لمزيد من تقليل إنتاج dsRNA من خلال عازل التفاعل بالإضافة إلى ذلك، حصل فحص FADS أيضًا على متغيرات متعددة ذات سلامة منتج محسنة واستقرار حراري، مما قد يلبي متطلبات مجموعة أوسع من تطبيقات النسخ المختبرية
الشكل 3. تقييم تكوين dsRNA بواسطة متغيرات بوليميراز RNA T7 التي تم تقييمها باستخدام مجموعة Yeasen Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA وتحليل لطخة النقاط للأجسام المضادة J2.
في الوقت الحاضر، قام العديد من الشركاء بالفعل بمحاولة استخدام متغيرات بوليميراز T7 RNA وقد تلقينا منهم ثناءً عالياً. يؤدي استخدام الإنزيم الجديد إلى تبسيط عملية تنقية mRNA، وتعزيز كفاءة العمل، وإظهار أداء متميز في سيناريوهات التطبيق المتعددة.
نبذة عن شركة موليفيوتشر للتكنولوجيا الحيوية
شركة Molefuture Biotechnology هي شركة تابعة لشركة Yeasen شركة التكنولوجيا الحيوية (شنغهاي) المحدودة، متخصصة في توفير حلول تعديل الإنزيم المخصصة التي تعتمد على تكنولوجيا تطور الإنزيم.الاستفادة من موارد Yeasen تعمل شركة Molefuture في مجال التكنولوجيا الحيوية على ست منصات تكنولوجية رئيسية: منصة ZymeEditor المبتكرة لتطوير الإنزيم، ومنصة التعبير عالية الكفاءة متعددة المضيفات، ومنصة تطوير عملية التخمير، ومنصة تطوير عملية التنقية، ومنصة إنتاج الإنزيم فائق النظافة، ومنصة تحليل الإنزيم ومراقبة الجودة. ومن خلال هذه المنصات التكنولوجية الست، يمكن لشركة Molefuture تقديم مجموعة كاملة من الحلول المخصصة بما في ذلك التطور الموجه بالإنزيمات، وتطوير الإنزيم الجديد، وتطوير عملية الإنزيم، والإنتاج على مستوى GMP لتلبية متطلبات تطبيق الإنزيمات في مجالات مثل التشخيص المختبري، والطب الحيوي، وعلم الأحياء الاصطناعي، والجماليات الطبية، والوسائط الصيدلانية، وما إلى ذلك.
معلومات الطلب
فيما يلي المنتجات التمثيلية التي تقدمها شركة Yeasen. تتوفر أحجام إضافية. منتجاتنا مُحسَّنة للغاية للعمل في انسجام، للمساعدة في ضمان الأداء المتفوق وإمكانية إعادة الإنتاج. يمكننا أيضًا تقديم خدمات مخصصة. إذا كنت مهتمًا بمنتج غير معروض، فاتصل بنا وسنعمل معك لتلبية احتياجاتك.
فيما يتعلق بالقراءة:
مراجع: