هل تبحث عن طريقة موثوقة للكشف عن بقايا dsRNA أثناء نسخ mRNA في المختبر؟ لا تبحث أبعد من مجموعة ELISA الخاصة بـ Double-stranded RNA (dsRNA). ومع ذلك، مع توفر العديد من المجموعات التجارية، من المهم ملاحظة أن بيانات التحقق قد لا تكون متاحة دائمًا للعامة، مما يؤدي إلى عدم الاتساق في الكشف عن dsRNA. لهذا السبب نشارك تقرير التحقق الخاص بنا لمجموعة ELISA الخاصة بـ Double-stranded RNA (dsRNA)، والذي يغطي الخصوصية والدقة والحساسية والمتانة. يعمل هذا التقرير كدليل مرجعي للتحقق من صحة طرق الكشف عن بقايا dsRNA المصممة وفقًا لظروف تجريبية محددة ومعايير دستور الأدوية التنظيمي. يرجى معرفة المزيد حول تقرير التحقق الخاص بنا لتعزيز توحيد معايير اكتشاف dsRNA.
اختبار الإليزا باستخدام الحمض النووي الريبوزي ثنائي السلسلة (dsRNA) كهو - هي
خلفية:
مجموعة ELISA لـ Double-stranded RNA (dsRNA) هي مجموعة كاشف مصممة للكشف عن بقايا dsRNA الناتجة أثناء عملية نسخ mRNA في المختبر. باستخدام المبدأ التجريبي لـ Double-stranded antibody immunolinked immunosorbed immunosorbed immunosorbed (ELISA) ونظام تضخيم البيوتين-ستربتافيدين، توفر هذه المجموعة الكشف الحساس عن بقايا dsRNA في العينات.
تحتوي بيانات الملخص على معلمات التحقق التي تغطي الخصوصية والدقة والحساسية والمتانة. يعمل التقرير كدليل مرجعي، يحث المستخدمين على التحقق من صحة طرق الكشف عن بقايا dsRNA المصممة خصيصًا لظروفهم التجريبية المحددة والالتزام بالمعايير التنظيمية للدستور الدوائي.
المواد والطرق:
عدة: طقم اختبار ELISA للحمض النووي الريبوزي ثنائي السلسلة (dsRNA): Cat#36717ES (YEASEN)تتضمن المجموعة أربعة أنواع مميزة من عينات dsRNA القياسية. ويتاح للمستخدمين خيار اختيار نوع العينة القياسية التي تتوافق مع عملية محددة لتوليد المنحنى القياسي، وبالتالي تجنب ضرورة تحضير واختبار جميع العينات.
الأساليب: تم تحديد المواد والخطوات الإجرائية الأساسية للتجربة بشكل أساسي بواسطة Yeasen Biotechnology. خضعت المجموعة لاختبارات وتقييم مكثفين، مما يضمن أن أدائها يلبي المتطلبات المنصوص عليها في ICH Q2(R1) وطبعة 2020 من دستور الأدوية الصيني الجزء الرابع "إرشادات التحقق من صحة الطريقة التحليلية 9101".
نتائج
- خطية معايير dsRNA
وقد طور هذا التقرير منحنيات قياسية لجميع الأنواع الأربعة المميزة من معايير dsRNA، كل منها بطول 300 زوج قاعدي. وتشمل هذه المعايير STD1، dsRNA غير المعدل؛ وSTD2، dsRNA المعدل Pseudo-UTP؛ وSTD3، dsRNA المعدل N1-Me-Pseudo-UTP؛ وSTD4، dsRNA المعدل 5-OMe-UTP. ويُظهِر كل نوع من معايير dsRNA خطية ممتازة للتخفيف مع R2 > 0.99 ومعامل تباين (CV) للتركيز المقاس أقل من 10% كما هو موضح في الجدول 1 إلى الجدول 5.
| اسم المرض الجنسي | نوع UTP | خطية التخفيف (ر2＞0.99) | السيرة الذاتية |
| الأمراض المنقولة جنسيا 1 | يو تي بي | 0.0156-1 بيكو جرام/ ميكرولتر | ＜10% |
| الأمراض المنقولة جنسيا 2 | بوتب | 0.0156-1 بيكو جرام/ ميكرولتر | ＜10% |
| الأمراض المنقولة جنسيا 3 | N1-Me-pUTP | 0.0312-1 بيكو جرام/ ميكرولتر | ＜10% |
| الأمراض المنقولة جنسيا رقم 4 | 5-أوم-يو تي بي | 0.0625-1 بيكو جرام/ ميكرولتر | ＜10% |
الجدول 1. خطية معايير dsRNA المختلفة.
| تركيز STD1ن. (بيكو جرام/ميكرولتر) | المتوسط المقاس (بيكو جرام/ميكرولتر) | استعادة | السيرة الذاتية |
| 1 | 1.0001 | 100.0% | 3.1% |
| 0.5 | 0.4994 | 99.9% | 2.4% |
| 0.25 | 0.2516 | 100.7% | 3.3% |
| 0.125 | 0.1227 | 98.1% | 0.5% |
| 0.0625 | 0.0640 | 102.5% | 3.2% |
| 0.0312 | 0.0309 | 99.2% | 1.3% |
| 0.0156 | 0.0157 | 100.4% | 3.2% |
| 0 | / | / | / |
الجدول 2.الاسترداد والسيرة الذاتية من STD1 المخفف
| تركيز STD2ن. (بيكو جرام/ميكرولتر) | المتوسط المقاس (بيكو جرام/ميكرولتر) | استعادة | السيرة الذاتية |
| 1 | 1.0001 | 100.0% | 0.7% |
| 0.5 | 0.4994 | 99.9% | 0.1% |
| 0.25 | 0.2514 | 100.6% | 0.9% |
| 0.125 | 0.1232 | 98.6% | 2.5% |
| 0.0625 | 0.0635 | 101.6% | 1.1% |
| 0.0312 | 0.0312 | 99.9% | 0.5% |
| 0.0156 | 0.0155 | 99.6% | 0.0% |
| 0 | / | / | / |
الجدول 3. الاسترداد و CV من STD2 المخفف
| STD3 مرتبط. (بيكو جرام/ميكرولتر) | المتوسط المقاس (بيكو جرام/ميكرولتر) | استعادة | السيرة الذاتية |
| 2 | 2.0031 | 100.2% | 1.6% |
| 1 | 0.9880 | 98.8% | 2.4% |
| 0.5 | 0.5188 | 103.8% | 1.2% |
| 0.25 | 0.2383 | 95.3% | 2.2% |
| 0.125 | 0.1242 | 99.4% | 0.1% |
| 0.0625 | 0.0629 | 100.7% | 1.8% |
| 0.0312 | 0.0361 | 115.7% | 1.6% |
| 0 | / | / | / |
الجدول 4. الاسترداد و CV من STD3 المخفف
| STD4 متصل. (بيكو جرام/ميكرولتر) | المتوسط المقاس (بيكو جرام/ميكرولتر) | استعادة | السيرة الذاتية |
| 4 | 4.0096 | 100.2% | 1.9% |
| 2 | 1.9940 | 99.7% | 0.7% |
| 1 | 0.9977 | 99.8% | 0.1% |
| 0.5 | 0.5108 | 102.2% | 0.1% |
| 0.25 | 0.2454 | 98.2% | 5.6% |
| 0.125 | 0.1207 | 96.5% | 2.8% |
| 0.0625 | 0.0624 | 99.9% | 0.3% |
| 0 | / | / | / |
الجدول 5. الاسترداد و CV من STD4 المخفف
-
الخصوصية
- تحليل الخصوصية باستخدام dsRNA وssRNA وdsDNA وssDNA.
- لم تتأثر الخصوصية بطول dsRNAs.
-
أالدقة
إضافة 0.5 بيكو جرام/ميكرولتر من STD1 تم إجراء التحليل على عينة mRNA معروفة بمحتوى dsRNA يبلغ 0.36 بيكو جرام/ميكرولتر في ثلاث نسب حجم مختلفة (1:1، 1:20، 1:250). في جميع الحالات، تراوحت معدلات استرداد السنبلة بين 80% و120%.
يتم حساب معدل استرداد السنبلة على النحو التالي: السنبلة استعادة المعدل=(المقاس تركيز بعد ارتفاع × إجمالي مقدار ل مسنن العينة - المقاسة تركيز ل ال العينة × المجموع مقدار ل ال العينة)/(النظرية تركيز ل ال ارتفاع × حجم ل ال السنبلة)×100%
| العينات | نسبة الحجم لـ STD1/العينة | قياس dsRNA (بيكو جرام/ميكرولتر) | يرتقع استعادة معدل |
| العينة (TS) | / | 0.36 | / |
| TS+0.5 بيكو جرام/ميكرولتر الأمراض المنقولة جنسيا 1 | 1:1 | 0.769 | 81% |
| TS+0.5 بيكو جرام/ميكرولتر الأمراض المنقولة جنسيا 1 | 1:20 | 0.777 | 82% |
| TS+0.5 بيكو جرام/ميكرولتر الأمراض المنقولة جنسيا 1 | 1:250 | 0.803 | 82% |
الجدول 6. معدل استرداد السنبلة تحليل
-
دقة
- دقة داخل الاختبار
تم إجراء التجارب على ثلاثة مستويات تركيز (عالية ومتوسطة ومنخفضة) لكل من عينات dsRNA الأربعة القياسية. في تجربة واحدة، خضعت كل عينة تركيز لثمانية اختبارات متكررة. تظهر النتائج أن معامل التباين (CV) أقل من 15٪ مما يشير إلى دقة جيدة داخل الاختبار.
| الأمراض المنقولة جنسيا 1 | |||
| نظري مركز (بيكو جرام/ميكرولتر) | تكرار | المتوسط المقاس (بيكو جرام/ميكرولتر) | السيرة الذاتية |
| 1 | 8 | 1.0002 | 3.11% |
| 0.125 | 8 | 0.1230 | 0.46% |
| 0.0156 | 8 | 0.0164 | 3.18% |
| الأمراض المنقولة جنسيا 2 | |||
| نظري مركز (بيكو جرام/ميكرولتر) | تكرار | المتوسط المقاس (بيكو جرام/ميكرولتر) | السيرة الذاتية |
| 1 | 8 | 1.0001 | 0.65% |
| 0.125 | 8 | 0.1231 | 2.46% |
| 0.0156 | 8 | 0.0162 | 0.02% |
| الأمراض المنقولة جنسيا 3 | |||
| نظري مركز (بيكو جرام/ميكرولتر) | تكرار | المتوسط المقاس (بيكو جرام/ميكرولتر) | السيرة الذاتية |
| 2 | 8 | 2.0022 | 1.58% |
| 0.25 | 8 | 0.2444 | 2.17% |
| 0.0312 | 8 | 0.0328 | 1.64% |
| الأمراض المنقولة جنسيا رقم 4 | |||
| نظري مركز (بيكو جرام/ميكرولتر) | تكرار | المتوسط المقاس (بيكو جرام/ميكرولتر) | السيرة الذاتية |
| 8 | 8 | 8.0803 | 0.27% |
| 1 | 8 | 0.9650 | 0.12% |
| 0.125 | 8 | 0.1322 | 2.76% |
الجدول 7. تحليل الدقة داخل الاختبار
- دقة بين الاختبارات
تم إجراء ثلاث تجارب باستخدام مجموعات من 3 دفعات. في كل تجربة، تم اختيار تركيزات عالية ومتوسطة ومنخفضة واختبارها ثلاث مرات لكل من عينات dsRNA الأربعة القياسية، مع ثماني مكررات. وبالتالي، تم الحصول على 24 نقطة بيانات في كل تجربة. مستوى التركيز، والتي تم استخدامها بعد ذلك لتحليل معامل التباين (CV). وأظهرت النتائج أن معامل التباين لكل تركيز من المعايير كان أقل من 15٪.
| الأمراض المنقولة جنسيا 1 | |||
| نظري مركز (بيكو جرام/ميكرولتر) | الاختبارات المستقلة/التكرارات | المتوسط المقاس (بيكو جرام/ميكرولتر) | السيرة الذاتية |
| 1 | 3/8 | 1.0007 | 2.38% |
| 0.125 | 3/8 | 0.1186 | 3.20% |
| 0.0156 | 3/8 | 0.0173 | 1.27% |
| الأمراض المنقولة جنسيا 2 | |||
| نظري مركز (بيكو جرام/ميكرولتر) | الاختبارات المستقلة/التكرارات | المتوسط المقاس (بيكو جرام/ميكرولتر) | السيرة الذاتية |
| 1 | 3/8 | 0.9987 | 0.09% |
| 0.125 | 3/8 | 0.1269 | 1.06% |
| 0.0156 | 3/8 | 0.0151 | 0.52% |
| الأمراض المنقولة جنسيا 3 | |||
| نظري مركز (بيكو جرام/ميكرولتر) | الاختبارات المستقلة/التكرارات | المتوسط المقاس (بيكو جرام/ميكرولتر) | السيرة الذاتية |
| 2 | 3/8 | 2.0012 | 2.37% |
| 0.25 | 3/8 | 0.2415 | 0.14% |
| 0.0312 | 3/8 | 0.0330 | 1.81% |
| الأمراض المنقولة جنسيا رقم 4 | |||
| نظري مركز (بيكو جرام/ميكرولتر) | الاختبارات المستقلة/التكرارات | المتوسط المقاس (بيكو جرام/ميكرولتر) | السيرة الذاتية |
| 8 | 3/8 | 7.9735 | 1.89% |
| 1 | 3/8 | 1.0225 | 0.13% |
| 0.125 | 3/8 | 0.1227 | 5.63% |
الجدول 8. تحليل الدقة بين الاختبارات
-
حساسية
- لود
حد الكشف عن عدة يتم تحديد ذلك بإضافة ضعف الانحراف المعياري إلى متوسط قيم الفراغات. من خلال قياس OD لـ 24 فراغًا، وحساب متوسطها وانحرافها المعياري، ثم تطبيق هذه القيم على المنحنى الملائم، يتم تحديد حد الكشف المقابل تم الحصول عليها.
|
| تطوير ذاتي |
| ||
| dsRNA معيار | متوسط الفراغ | SD من الفراغ | متوسط الفراغ + 2SD | لود |
| الأمراض المنقولة جنسيا 1 | 0.016 | 0.00048 | 0.01696 | ≤0.001 بيكو جرام/ميكرولتر |
| الأمراض المنقولة جنسيا 2 | 0.016 | 0.00072 | 0.01744 | ≤0.001 بيكو جرام/ميكرولتر |
| الأمراض المنقولة جنسيا 3 | 0.034 | 0.00119 | 0.03638 | ≤0.001 بيكو جرام/ميكرولتر |
| الأمراض المنقولة جنسيا رقم 4 | 0.115 | 0.00290 | 0.1208 | ≤0.01 بيكو جرام/ميكرولتر |
الجدول 9. تحليل مستوى التفاصيل
- لوك
الحد الكمي ل عدة يتم تحديد ذلك عن طريق تخفيف أدنى نقطة تركيز للمنحنى القياسي إلى مستويات أقل، مما يضمن معامل تغير اللون < 20% عند أدنى تركيز، وبالتالي تحديد العتبة الكمية. الحد الأدنى للكمية هو كما يلي.
| dsRNA معيار | لوك | تكرار | السيرة الذاتية(%) | استعادة (%) |
| الأمراض المنقولة جنسيا 1 | 0.0156 بيكو جرام/ميكرولتر | 24 | <10% | 80~120% |
| الأمراض المنقولة جنسيا 2 | 0.0312 بيكو جرام/ميكرولتر | 24 | <10% | 80~120% |
| الأمراض المنقولة جنسيا 3 | 0.0156 بيكو جرام/ميكرولتر | 24 | <10% | 80~120% |
| الأمراض المنقولة جنسيا رقم 4 | 0.125 بيكو جرام/ميكرولتر | 24 | <10% | 80~120% |
-
دالمتانة
- مضاد للتداخل على مواد IVT
هذا الاختبار تهدف إلى تقييم تأثير الإنزيمات المختلفة، والمخازن المؤقتة، وما إلى ذلك، المضافة إلى الرنا المرسال عينة على الكشف عن dsRNA بواسطة المجموعة.
إضافة تركيزات محددة من بوليميراز T7 RNA، ومثبط RNAse، وIPPA (بيروفوسفاتاز غير عضوي)، وDNase I، وVCE (إنزيم تغطية اللقاح)، و2'-O-Methyltransferase (MT)، ومحلول 1×IVT، و1mM سترات الصوديوم إلى عينة mRNA المقدمة، ثم استخدام STD3 لكل من إعداد المنحنى القياسي واختبار العينة، مكّن من تقييم قدرة المجموعة على اكتشاف محتوى dsRNA في هذه أظهرت النتائج أن وجود ثمانية إنزيمات ومخازن مختلفة لم يؤثر على دقة الكشف عن dsRNA. بالإضافة إلى ذلك، تراوحت معدلات الاسترداد الملحوظة بين 80% إلى 120%.
| مواد IVT | dsRNA تم قياسه (بيكو جرام/ميكرولتر) | استعادة |
| لا أحد | 0.6057 | 100% |
| بوليميراز الحمض النووي الريبوزي T7 (15 ميكروجرام/مل) | 0.5411 | 89.32% |
| مثبط RNase الفأري (27.5 ميكروجرام / مل) | 0.5142 | 84.88% |
| بيروفوسفاتاز غير عضوي (IPPA 10μg/mL) | 0.7132 | 117.7% |
| DNase I (13.75 ميكروجرام/مل) | 0.6077 | 100.32% |
| إنزيم تغطية الجدري (10 ميكروجرام/مل) | 0.6563 | 108.3% |
| 2´-O-ميثيل ترانسفيراز (10 ميكروجرام/مل) | 0.5776 | 95.4% |
| 1×مخزن مؤقت IVT | 0.5003 | 82.6% |
| 1 مليمتر سترات الصوديوم | 0.6251 | 103.2% |
الجدول 11. استعادة STD3 المخفف المضاف إلى مواد IVT
- درجة الحرارة دالمتانة
تم تخزين الأدوات في كلا 4 درجة مئوية و 37 درجة مئوية للكشف عن فروق تركيز معيار dsRNA بعد 7 أيام. أظهرت النتائج أن جميع الفروقات كانت في حدود 20%.
| dsRNA معيار | dsRNA تم قياسه (بيكو جرام/ميكرولتر) اليوم 0 | الاختلافات بعد 7 أيام عند 4 درجات مئوية |
| الأمراض المنقولة جنسيا 1 | 1 | 10% |
| الأمراض المنقولة جنسيا 2 | 1 | 5% |
| الأمراض المنقولة جنسيا 3 | 2 | 7% |
| الأمراض المنقولة جنسيا رقم 4 | 4 | 11% |
| dsRNA معيار | dsRNA تم قياسه (بيكو جرام/ميكرولتر) | الاختلافات بعد 7 أيام عند 37 درجة مئوية |
| الأمراض المنقولة جنسيا 1 | 1 | 18% |
| الأمراض المنقولة جنسيا 2 | 1 | 4% |
| الأمراض المنقولة جنسيا 3 | 2 | 5% |
| الأمراض المنقولة جنسيا رقم 4 | 4 | 8% |
الجدول 12. تحليل متانة درجة الحرارة
المنتج ذو الصلة:
| اسم المنتج | رقم المنتج | تحديد |
| مجموعة اختبار ELISA للحمض النووي الريبوزي ثنائي السلسلة (dsRNA) | 36717ES | 48 طن/96 طن |
| بوليميراز الحمض النووي الريبوزي CleaScrip™ T7 (حمض نووي ريبوزي منخفض، 250 وحدة/ميكرولتر) | 10628ES | 10/100 كو |
| بوليميراز الحمض النووي الريبوزي T7 درجة GMP (250 وحدة / ميكرولتر) | 10625ES | 10/100 كو |
قراءة ذات صلة:
تم استخدام مجموعة ELISA ذات الحمض النووي الريبي مزدوج السلسلة (dsRNA) للتحقق من صحة الطفرات منخفضة بوليميراز الحمض النووي الريبي dsRNA T7، بالتزامن مع طريقة النقل النقطي للأجسام المضادة J2.
طفرات بوليميراز RNA T7 ذات dsRNA المنخفضة، وتمكين تطوير لقاحات وعلاجات mRNA
مراجع:
- ICH, 2022: التحقق من صحة الطريقة التحليلية، الربع الثاني، نسخة المسودة.
- NMPA، 2007: المبادئ العامة لتقييم التحقق من صحة الطريقة التحليلية لتحليل مراقبة جودة المنتجات البيولوجية
- لجنة دستور الأدوية الصيني (ChPC)، 2020: دستور الأدوية الصيني، الجزء الرابع: إرشادات للتحقق من صحة طرق التحليل الكمي للعينات البيولوجية