في السنوات الأخيرة، حظيت الأدوية المعتمدة على mRNA باهتمام كبير وجذبت تركيزًا بحثيًا. يُعرف T7 RNAP ببساطته وقدرته على تحفيز تخليق الحمض النووي الريبي مع إنتاجية عالية و ولكن أثناء عملية النسخ، يمكن أن ينتج T7 RNAP منتجات ثانوية مثل الحمض النووي الريبي القصير الفاشل، والحمض النووي الريبي المنتهي قبل الأوان، والحمض النووي الريبي الممتد 3'، مما يخلق ظروفًا مواتية لتكوين الحمض النووي الريبي ثنائي الترابط. لذلك، أصبح تقليل إنتاج الحمض النووي الريبي ثنائي الترابط ضرورة ملحة في التطبيقات العملية.
وفي الآونة الأخيرة، أجريت دراسة رائدة بعنوان "أدى تعديل FADS وتصميم شبه عقلاني لبوليميراز RNA T7 إلى تقليل إنتاج dsRNA، مع انخفاض نشاط الترانسفيراز الطرفي وRDRP"تم نشر هذه الدراسة على الإنترنت بواسطة Yeasen وفريق Molefuture. نجح الباحثون في هندسة T7 RNAP لتقليل إنتاج المنتجات الثانوية لـ dsRNA بشكل كبير أثناء النسخ، مما أدى إلى تقليصها إلى 1.8% من الإنزيم البري من خلال مزيج من التطور الموجه والتصميم شبه العقلاني.
فحص T7 RNAP على أساس FADS
لفحص T7 RNAP، تم اختيار FADS (فرز القطرات المنشطة بالفلورسنت) لتلبية متطلبات الإنتاجية العالية لتطور البروتين. لمنع التفتت المبكر للخلايا، استخدم الباحثون شريحة PDMS ذات طورين مائيين، حيث تم خلط الليزوزيم بالخلايا الموجودة على الشريحة ومارس نشاطه داخل القطرات الشكل 1قام الباحثون بإنشاء العديد من مكتبات الطفرات العشوائية بتنوع يتراوح من 105 الى 106بعد الفحص، تم تحديد 10 متغيرات مهيمنة وتم تصنيفها على أنها Mut1 إلى Mut10. كما هو موضح في الشكل 2E و الشكل 2Fكان محتوى dsRNA في Mut1 وMut7 وMut9 أقل بشكل ملحوظ من محتوى النوع البري
الشكل 1. نظرة عامة على FADS
الشكل 2. فحص المكتبة العشوائية وتقييم المتغيرات
التصميم شبه العقلاني لـ T7 RNAP
الباحثون أجرى استكشافًا للتصميم شبه العقلاني، وأنشأ عشر مكتبات مشبعة بموقع واحد واستخدم طريقة المجسات المزدوجة التقليدية القائمة على لوحة الميكروتيتر للفحص (الشكل 3). يتم استخدام مسبار الطرف 5 المضاف للكشف عن إنتاج الحمض النووي الريبي.
الشكل 3. تصميم شبه عقلاني موجه بالبنية لتقليل dsRNA
بعد فحص أكثر من 1000 طفرة، قام الباحثون تم تحديد ستة مرشحين: Mut11 (K180E)، وMut12 (S228F)، وMut13 (G238L)، وMut14 (A70Q)، وMut15 (A383H)، وMut16 (I743L). لم يختلف إجمالي إنتاج الحمض النووي الريبي لجميع الطفرات الستة بشكل كبير عن النوع البري، مما يشير إلى كفاءة نسخ إجمالية قابلة للمقارنة. ومن المتوقع أن يكون محتوى الحمض النووي الريبي ثنائي الشق في Mut11 وMut14 أقل بشكل ملحوظ مقارنة بالنوع البري (الشكل 4).
الشكل 4. فحص لوحة الميكروتيتر وتقييم المتغيرات
ينتج Mut17 من خلط الحمض النووي كمية أقل من dsRNA
لتحسين T7 RNAP بشكل أكبر، تم اختيار أربعة متغيرات ذات محتوى منخفض من dsRNA مع تلبية متطلبات الإنتاج.قام الباحثون بعد ذلك ببناء مكتبة خلط الحمض النووي وفحصها باستخدام صفائح ميكروتيتر، وحددوا متغيرًا أظهر إنتاجًا أقل من dsRNA مقارنة بـ T7 RNAP الأصلي، والذي أطلق عليه اسم Mut17 (A70Q/F162S/K180E). ثم قاموا بعد ذلك بتحليل المنتجات النسخية لـ Mut17 ومتغيراته الأصلية (Mut14 وMut11 وMut7). كما هو موضح في الشكل 5أظهرت جميع المتغيرات الأربعة انخفاضًا كبيرًا في إنتاج dsRNA أثناء النسخ مقارنة بالنوع البري. ومن اللافت للنظر أن Mut17 أظهر محتوى أقل بكثير من dsRNA بنسبة 1.80% فقط وبأقل من 0.007 نانوجرام/ميكروجرام في نظام المذيبات للفحص.
الشكل 5. محتوى dsRNA في Mut17 والطفرات الأصلية
إن المناعة لمنتج IVT من الطفرة أقل بكثير من المناعة الموجودة في النوع البري.
التالي، لقد قمنا بتقييم المناعة لمنتجات IVT في مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي لدى الفئرانW264.7 خلايا. كما هو موضح في الشكلين 2أ و2ب، انخفضت مستويات mRNA وبروتين IFN-β في RAW264أظهرت نتائج دراسة أجريت على 0.7 خلايا معدلة باستخدام mRNA المنتجة بواسطة الطفرات مقارنة بالنوع البري، أن mRNA الذي تم تصنيعه بواسطة T7 RNAP من النوع البري أثار أقوى استجابة مناعية، في حين أظهر mRNA من الطفرات استجابة منخفضة بشكل ملحوظ. على وجه التحديد، كان mRNA لـ IFN-β في الخلايا المعالجة بـ Mut11 RNA يمثل 9.7% فقط من الخلايا المعالجة من النوع البري، وكان بروتينه 12.93 بيكو جرام/مل. وعلاوة على ذلك، لم يُظهِر التعبير عن EGFP أي اختلافات كبيرة في الكمية أو الجودة بين mRNAs الناتجة عن T7 RNAPs المختلفة (الشكل 6ج)، تلبية متطلبات التطبيقات الصناعية.
الشكل 6. استجابة IFN-β وتعبير EGFP في الخلايا الثديية
إن أنشطة RDRP والترانسفيراز الطرفي للطفرة أقل بكثيرنحنر من تلك من النوع البري.
للتحقق من تأثير الطفرات على اختزال dsRNA، قام الباحثون أجريت دراسات حاسوبية على كل هذه الطفرات. تشير النتيجة إلى وجود إشارة واضحة إلى انخفاض نشاط RDRP في المتغيرات، حيث تظهر ميلًا منخفضًا لاستخدام RNA كقالب. وبالمثل، قد يكون لهذا تأثير على نشاط ترانسفيراز الطرفية لـ T7 RNAP. كما هو موضح في شكل 7تحت تركيزات مختلفة، أظهرت جميع المتغيرات الأربعة أقل من 50% من قيمة الفلورسنت مقارنة بالنوع البري.
بعد ذلك، تم استخدام اختبار عدم التجانس 3'-end لوصف نشاط النقل الطرفي لـ T7 RNAP. عند التركيز على نسبة RNA مع n>0، والتي تعكس نشاط النقل الطرفي، قام الباحثون وجد أن هذه الحمض النووي الريبوزي شكلت 82.94% في النوع البري، بينما أظهرت الطفرات النسب المئوية التالية: Mut11 (70.29%)، Mut7 (67.88%)، Mut14 (63.31%)، و Mut17 (55.62%) (شكل 8)ومن المهم أن هذه النسب تتوافق إلى حد كبير مع وفرة dsRNA في المنتجات (الشكل 5)تشير هذه النتائج إلى انخفاض كبير في نشاط الناقل الطرفي للطفرات، والذي يساهم، جنبًا إلى جنب مع انخفاض نشاط RDRP، في انخفاض dsRNA.على وجه التحديد، قد يلعب نشاط الترانسفيراز الطرفي دورًا أكثر أهمية، كما يتضح من أدنى تراكم لـ n>0 RNAs الملحوظ في Mut17، والذي يُظهر أيضًا أدنى إنتاج لـ dsRNA (الشكل 5 والشكل 8).
شكل 7. نشاط RDRP النسبي
شكل 8. التباين في منتجات نهاية 3' من الحمض النووي الريبي
خاتمة
تقدم هذه الدراسة منهجية قوية لتحديد الطفرات ذات محتوى منخفض من dsRNA وتعزل بنجاح العديد من الطفرات dsRNA التي لديها نشاط منخفض من بوليميراز RNA المعتمد على RNA وTerminal Transferase. إنها تعزز بشكل كبير من صحة السلامة والفعالية المتكاملة لعلاجات mRNA، مما يؤكد على آثارها العميقة على تطوير لقاحات mRNA وتطبيقات العلاج الجيني.
في الوقت نفسه، الشركة الأم Yeasen كما أطلقت أيضًا منتج T7 RNAP الذي يقلل بشكل كبير من dsRNA المحتوى. لقد قام العديد من الشركاء بالفعل باختبار الطفرات المعدلة لـ T7 RNAP التي طورتها شركة Molefuture وقد حظي المنتج بتقدير كبير من العملاء. يعتقد عملاؤنا أن استخدام الإنزيم الجديد يبسط عملية تنقية mRNA ويقلل بشكل كبير من مناعة IVT المنتجات، تظهر أداءً متميزًا في سيناريوهات تطبيق متعددة، مما يثبت إمكاناتها الواسعة في مجال المستحضرات الصيدلانية الحيوية!
معلومات الطلب
فيما يلي المنتجات التمثيلية التي تقدمها شركة Yeasen. تتوفر أحجام إضافية. منتجاتنا مُحسَّنة للغاية للعمل في انسجام، للمساعدة في ضمان الأداء المتفوق وإمكانية إعادة الإنتاج. يمكننا أيضًا تقديم خدمات مخصصة. إذا كنت مهتمًا بمنتج غير معروض، فاتصل بنا وسنعمل معك لتلبية احتياجاتك.