لقد أظهر التسلسل الجيني للجيل التالي (NGS) آفاقًا واسعة للغاية للتطبيق البحثي السريري والعلمي في مجالات مثل اكتشاف مسببات الأمراض، واكتشاف طفرة الورم، وعلم الوراثة التناسلية بسبب حساسيته العالية للكشف، وخصوصيته القوية، والقدرة على إجراء الكشف النوعي والكمي. يعتبر إنشاء المكتبة، كخطوة أساسية في NGS، مؤثرًا بشكل مباشر على جودة التسلسل. بناءً على إرشادات مراجعة التسجيل لمنتجات التشخيص المختبري، يجب توفير بيانات البحث الخاصة بالمواد الخام الرئيسية. يجب إجراء تحليل شامل والتحقق من خلال الجمع بين عوامل مثل المعلومات الأساسية ومؤشرات المعلمات ومصادر توريد المواد الخام لتحديد المصدر الأكثر ملاءمة للمواد الخام. تتضمن عملية بناء مكتبة DNA وRNA التقليدية بشكل أساسي خطوات رئيسية مثل تخليق cDNA وتفتيت DNA وربط المحول وتضخيم المكتبة، تحتوي الخطوات المختلفة على أنواع عديدة من إنزيمات المواد الخام. إن فحص إنزيمات المواد الخام يطيل دورة البحث. وعلى هذا الأساس، أصبحت منتجات وحدات بناء المكتبات البسيطة والفعّالة من حيث التكلفة خيارًا جديدًا لتطوير منتجات IVD.
الشكل 1. عملية بناء مكتبة الحمض النووي التقليدية (على اليسار) وعملية بناء مكتبة الحمض النووي الريبي (على اليمين)، مع الأخذ في الاعتبار منصة Illumina كمثال
إن التخليق النسخي العكسي هو الجزء الأساسي من RNA-Seq، جديد نوع من ارتفاع النسخ العكسي ذو الكفاءة العالية، والذي يدمج وظائف متعددة مثل الحساسية العالية، أَثْمَر إن تحليل cDNA والتوافق مع قوالب الهياكل المعقدة هو نقطة بحث ساخنة. حصلت منصة تعديل الإنزيم ZymeEditor™ من Yeasen على منتج نسخ عكسي شامل مع أداء محسن بشكل شامل من خلال التعديل الاتجاهي لـ M-MLV. يمكن استخدامه في سيناريوهات تطبيق متعددة مثل RNA-seq، وتسلسل الخلية الفردية، واستنساخ cDNA وبناء المكتبة.
الشكل 2. أداء 13488ES المطبق في RNA-seq
بسبب طول القراءة القصير لمنصة التسلسل، يجب تجزئة الحمض النووي عشوائيًا قبل إنشاء المكتبة. في المرحلة المبكرة، كانت عملية التفتت الأنزيمي صعبة بسبب مشاكل التوحيد والتحيز. ييسن للتكنولوجيا الحيوية لقد طورت اثنين من إنزيم التفتيت الفريدين، إنزيم تجزئة قوي المفعول يعمل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3-30 دقيقة وإنزيم تجزئة خفيف المفعول يعمل عند 30 درجة مئوية لمدة 10-40 دقيقة. إن منتجات التجزئة الأنزيمية المعتمدة على التجزئة العشوائية تتحسن عيوبها تدريجيًا، يتم دمجها في منتجات معيارية لتفتيت الحمض النووي وإصلاح النهاية والذيل A الذي يلبي المتطلبات العديدة للعينات المختلفة وأنواع التسلسل المختلفة.
الشكل 3. تأثيرات التفتت لإنزيمات تفتيت الحمض النووي المختلفة: إنزيم التفتت شديد التأثير (على اليسار) وإنزيم التفتت خفيف التأثير (على اليمين)
يعد معدل تحويل المكتبة مؤشرًا مهمًا لتقييم جودة المكتبة، حيث يشير معدل التحويل المرتفع للمكتبة إلى حد ما إلى ثراء أفضل للمكتبة وتوحيد أفضل لبيانات التسلسل. تركز رباطات الحمض النووي T4 التقليدية على تحسين الربط عالي الكفاءة، ولكن الأجزاء معرضة للربط الذاتي، مما يقلل من معدل تحويل المكتبة ويؤثر على ثراء المكتبة وجودة التسلسل. تقوم منصة هندسة الإنزيم Yeasen ZymeEditor™ بإجراء تعديل اتجاهي على T4 DNA Ligase للحصول على متحولة جديدة، تم تطوير منتج وحدة الربط مع استقرار حراري عالي ومعدل ربط ذاتي منخفض للأجزاء، باستخدام مخزن ربط محسن بعناية، مما يحسن بشكل كبير معدل تحويل المكتبة.
الشكل 4. الاستقرار الحراري وتحليل بقايا الرابط 12996ES
تعتبر جميع إنزيمات تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل مطلوبة في طرق تحضير مكتبة NGS. تتمتع معظم بوليميرات الحمض النووي عالية الدقة بنشاط بوليميراز 5'→3' ونشاط إكسونوكلياز 3'→5'، يمكنه تصنيع الحمض النووي في الاتجاه 5'→3' مع تصحيح القواعد المدمجة بشكل خاطئ، وبالتالي، فإنه قادر على تضخيم أجزاء الحمض النووي بسرعة وبدقة عالية. ولكن تم تصميم عدد قليل من الإنزيمات خصيصًا لـ NGS، لا يوجد الكثير من منتجات تضخيم المكتبة التي تتميز بالكفاءة والدقة والمحددة والقادرة على تضخيم أهداف ذات أحجام ومحتويات GC مختلفة دون تحيز، وفي الوقت نفسه لديها القدرة على خلط البادئات مسبقًا. قامت شركة Yeasen Biotechnology بتطوير بوليميراز DNA عالي الدقة بتصميم فريد ومزيج مسبق محسن لتفاعل البوليميراز المتسلسل الساخن، وهو مصمم خصيصًا لتضخيم مكتبة NGS بكفاءة ودقة عالية ومنخفض التحيز، مما يعالج تحديات تضخيم مكتبة NGS المعقدة.
الشكل 5. تحليل معدل خطأ الاستقرار والتضخيم لـ 12980ES
بالإضافة إلى سلسلة منتجات وحدة بناء مكتبة NGS المذكورة أعلاه، نحن نقدم أيضًا منتجات إنزيمية خام شاملة، لتلبية الاحتياجات المشتركة للعملاء المختلفة. تخضع منتجات المواد الخام لبناء مكتبة NGS من Yeasen لمعايير صارمة لمراقبة جودة المصنع، ومراقبة صارمة لأداء الدفعة وجودة الاستقرار، بحيث يمكنك بناء المكتبات دون قلق.
| فئة المنتج | اسم المنتج | رقم القط. | ملاحظة |
| تخليق الحمض النووي التكميلي بكفاءة | هيفير™ النسخ العكسي الفائق (200 وحدة/ميكرولتر) | 14604ES | إنزيم النسخ العكسي |
| هييف NGS™ مجموعة تصنيع ds-cDNA | 13488ES | وحدة تركيب الحمض النووي التكميلي | |
| الحمض النووي التفتيت والإصلاح النهائي والإصلاح الجزئي | هييف™ سميراز | 12907ES | شظايا الحمض النووي |
| وحدة تجزئة الحمض النووي Hieff NGS™ OnePot Pro (إصلاح النهاية وdA-tailing plus) | 12619ES | الحمض النووي تجزئة وإصلاح النهاية ووحدة الذيل A | |
| الإصلاح و الذيل | وحدة إصلاح الطرف السريع Hieff NGS®/dA-Tailing | 12608ES | وحدة الإصلاح النهائي ووحدة الذيل |
| ربط المحول | 10299ES | رباط الحمض النووي T4 | |
| تضخيم المكتبة | 2 × مزيج تضخيم Ultima HF | 13344ES | إنزيم عالي الدقة |