في التسلسل عالي الإنتاجية، يتطلب بناء المكتبة التقليدية تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل. من ناحية، يتم تضخيم عينات الحمض النووي النزرة وزيادة إنتاج المكتبة. من ناحية أخرى، يمكن تضخيم الإشارات الفلورية، مما يسهل على أجهزة التسلسل التقاط وتحديد الإشارات الفلورية لتحسين دقة التسلسل. ومع ذلك، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل يشبه "السيف ذو الحدين". أثناء حل مشكلة انخفاض حجم العينة الأولية وتضخيم الإشارة الفلورية، فإنه يقدم أيضًا أخطاء وتحيزات التضخيم، ولا يمكنه تقديم تسلسل الجينوم "الوجه الحقيقي" بشكل مثالي. بالإضافة إلى ذلك، فإن بوليميراز تفاعل البوليميراز المتسلسل لديه تحيز تضخيم معين. بعض المناطق، وخاصة GC العالي أو GC المنخفض، والبنية الثانوية، والمناطق الأخرى، لديها كفاءة تضخيم منخفضة ويصعب تغطيتها. كما سيقدم عددًا كبيرًا من InDels الخاطئة ويجلب عددًا كبيرًا من التكرار. مما يتسبب في إهدار حجم بيانات الحمض النووي وزيادة تكلفة التسلسل. لذلك، فإن إدخال تقنية PCR-Free لا يتمتع بمزايا PCR فحسب، بل يتغلب أيضًا على عيوب PCR. لا يمكنها فقط جلب مكتبات عالية الجودة ذات حساسية عالية، وتحقيق اكتشاف عينات التتبع، بل تتمتع أيضًا بدقة عالية وتقليل عبء عمل التحقق من صحة المتابعة للدراسات المتحورة. إذن، ما هي مكتبة PCR-Free بالضبط وما هي مزاياها؟

1. ما هي مكتبة PCR-Free؟
2. ما هي مزايا تقنية PCR-Free؟
3. عرض بيانات PCR-Free
4. الأسئلة الشائعة
5. معلومات المنتج
6. فيما يتعلق بالقراءة

1. ما هي مكتبة PCR-Free؟

تعد تقنية تسلسل الجيل التالي هي التقنية الأكثر استخدامًا في أبحاث التسلسل عالية الإنتاجية في علم الأحياء الجزيئي الحديث. لم يعد تسلسل الجيل الأول التقليدي قادرًا على تلبية احتياجات الباحثين بالكامل. تتطلب إعادة تسلسل الجينوم للكائنات النموذجية وتسلسل الجينوم للكائنات غير النموذجية تكلفة أكبر. تكنولوجيا تسلسل منخفضة وأعلى إنتاجية وأسرع، وبالتالي ولادة تقنية تسلسل الجيل الثاني. المبدأ الأساسي لتقنية تسلسل الجيل الثاني هو التسلسل عن طريق التخليق، أي تحديد تسلسل الحمض النووي من خلال التقاط معلومات القاعدة المسمّاة النهائية التي تم تخليقها حديثًا. المبدأ الرئيسي لتقنية تسلسل الجيل الثاني لتسلسل الحمض النووي هو تجزئة الحمض النووي أولاً، وإصلاح نهاية الحمض النووي المجزأ، ثم إضافة محولات محددة على كلا الجانبين ثم استخدام طرق مختلفة لتوليد ملايين من تفاعلات البوليميراز المتسلسل الثابتة مكانيًا. بالنسبة للمصفوفات الاستنساخية، يتم الحصول على بيانات التسلسل باستخدام التهجين الأولي وتفاعلات التمديد الأنزيمية لتصوير العلامات الفلورية المدمجة بواسطة كل تفاعل تمديد.

يتضمن تسلسل الحمض النووي من خلال تسلسل الجيل التالي بشكل أساسي عمليتين: تحضير المكتبة والتسلسل على الجهاز. أثناء تحضير المكتبة، يتم عادةً تضخيم شظايا الجينوم المتقطعة عشوائيًا بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي. ومع ذلك، بالنسبة لبعض القوالب الخاصة، توجد عوامل مثل البنية الثانوية المعقدة أو الاستقرار الحراري الضعيف، والتي تؤثر على تفضيل التضخيم لتفاعل البوليميراز المتسلسل القالب، لذلك لا يمكن عكس جميع التسلسلات الجينومية بالتساوي في مكتبة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل. وخاصة بالنسبة لبعض القوالب ذات المحتوى العالي من GC أو AT، يكون من الصعب أحيانًا استخدام طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل للتضخيم لبناء المكتبة. لا يوجد فرق بين المكتبة الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل ومكتبة تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية عند التسلسل على الجهاز، باستثناء عدم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل أثناء عملية بناء المكتبة. يمكن للمكتبة الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل من الناحية النظرية تحسين توزيع قراءات البيانات وتوليد تغطية جينوم أكثر اتساقًا.المكتبة الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل هي مكمل لطريقة إنشاء المكتبة. نظرًا لأنها مُعدة مباشرةً في مكتبة على متن الطائرة بدون تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل، يمكنها تحسين تغطية بعض مناطق GC أو AT العالية، وبالتالي تقليل قواعد الخطأ التي يسببها تفاعل البوليميراز المتسلسل، وتحيز البيانات، وتكرار التسلسل.

الخطوات الأساسية لبناء مكتبة NGS التقليدية هي تجزئة الجينوم وإصلاح النهاية وإضافة المحول وتفاعل البوليميراز المتسلسل وتضخيم الإشارة قبل التسلسل. إذن، ماذا عن بناء مكتبة خالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل؟ كما يوحي الاسم، فهي عملية بناء مكتبة لا تتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل. الخطوات الأساسية لبناء المكتبة هي تجزئة الجينوم وتعديل النهاية وإضافة الرابط ومراقبة جودة المكتبة. ولكن في الواقع، لا يمكن اعتبار هذا إلا خاليًا من تفاعل البوليميراز المتسلسل في عملية بناء المكتبة. يجب أن تكون العملية الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل الحقيقية عملية من بناء المكتبة إلى التسلسل بدون تضخيم المكتبة (مثل تقنية تسلسل الجزيء الفردي) أو تقنية تسلسل بدون تراكم أخطاء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (مثل DNBseq من MGI).

الشكل 1. مخطط انسيابي لبناء المكتبة التقليدية وبناء المكتبة الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل

2. ما هي مزايا تقنية PCR-Free؟

في عملية بناء المكتبة الروتينية، قد يُدخل إنزيم التضخيم أخطاء. ومن خلال التضخيم الدوري، ستتراكم هذه الأخطاء وتُضخم، مما يقلل من دقة تكرار تسلسل الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك، فإن بوليميراز الحمض النووي لديه أيضًا تحيز تضخيم معين، خاصة بالنسبة للمناطق ذات الاختلافات الكبيرة في محتوى GC أو الهياكل الثانوية، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة التضخيم وضعف توحيد التغطية؛ في حين أن إدخال InDels الخاطئ، سيؤدي أيضًا إلى حدوث عدد كبير من التكرار الذي يتسبب في إهدار حجم بيانات الحمض النووي وزيادة تكاليف التسلسل. يمكن لتقنية PCR-Free تجنب المشكلات المذكورة أعلاه التي أدخلها تضخيم PCR في بناء المكتبة التقليدي. في عملية بناء المكتبة والتسلسل، إذا كانت هناك عملية تضخيم PCR، فسيكون لها تأثير أكبر على توحيد تغطية الجينوم. بالنسبة لقوالب الحمض النووي، فإن بعضها يحتوي على هياكل ثانوية معقدة وبعضها يحتوي على اختلافات كبيرة في الاستقرار الحراري. ستؤثر هذه العوامل على كفاءة تضخيم PCR. لذلك، في عملية تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل، لا يمكن ضمان أن جميع الأجزاء الجينومية يمكنها الحصول على نفس كفاءة التضخيم، ولكن هناك تحيز تضخيم واضح، مثل التغطية المنخفضة في مناطق GC العالية أو GC المنخفضة من الجينوم. ومع ذلك، لا يوجد تفاعل البوليميراز المتسلسل في عملية التسلسل الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل بأكملها. بالمقارنة مع بناء مكتبة تفاعل البوليميراز المتسلسل، يتم تحسين تغطية مناطق GC العالية ومناطق التكرار AT/TA من الجينوم. المزايا المحددة هي كما يلي.

2.1 تبسيط عملية إعداد المكتبة، مما يوفر الوقت

يؤدي إعداد المكتبة بدون تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى التخلص من الحاجة إلى تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل والخطوات الأخرى، مما يؤدي إلى تبسيط عملية إعداد المكتبة وتوفير الوقت.

2.2 تقليل تكلفة إعداد المكتبة

في عملية إعداد المكتبة التقليدية، يتم استخدام إنزيمات عالية الدقة ومكلفة لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لضمان صحة التسلسل. وفي الوقت نفسه، يعمل PCR-Free على التخلص من خطوة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل، مما يقلل من تكاليف إعداد المكتبة.

2.3 تقليل تحيز التضخيم

تمتلك إنزيمات تضخيم الحمض النووي تحيزات تضخيم معينة، وخاصة بالنسبة للقوالب التي تحتوي على اختلافات كبيرة في محتوى GC أو البنية الثانوية. لذلك، يمكن لـ PCR-Free تجنب تحيز التضخيم الناتج عن البوليميراز بشكل فعال.

2.4 عدم تكرار تفاعل البوليميراز المتسلسل

يمكن لـ PCR-Free تقليل القراءات المكررة وزيادة معدلات التعيين الفريدة والاستخدام الفعال للبيانات.

2.5 تقليل نسبة الخطأ

من المرجح أن يؤدي تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى إدخال أخطاء تكرار في الإدراج والحذف، مما يؤدي إلى معدل خطأ أعلى في تسلسل الحذف والإدراج، في حين أن تقنية خالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل يمكن أن تتجنب بشكل فعال توليد وتراكم مثل هذه الأخطاء.

3. عرض بيانات PCR-Free

مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي المجانية Hieff NGS™ Ultima Pro PCR الإصدار 2 (Cat# 12196ES) لديه معدل تحويل مكتبة أفضل من المنتجات المنافسة.

الشكل 2. كمية بيانات التسلسل خارج الآلة لبناء مكتبة خالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل

4. الأسئلة الشائعة

س: ما هي أنواع العينات المناسبة للمكتبات الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل؟

أ: يمكن لبعض العينات ذات الهياكل الثانوية المعقدة، وGC العالية، وتفضيل PCR اختيار مكتبة خالية من PCR لإنشائها.

س: ما هو الحجم العام للمكتبة الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل؟

ج: لا توجد متطلبات خاصة لمكتبة PCR-free بحد ذاتها فيما يتعلق بحجم القطعة. يتم إنشاء مكتبة منتجات PCR وفقًا لحجم منتج PCR. بالنسبة للمكتبة الجينومية، يوصى بأن تكون حوالي 350bp، بحيث تكون جودة بيانات المكتبة جيدة نسبيًا.

5. معلومات المنتج

المنتج الذي يمكن لشركة Yeasen توفيره موضح في الجدول 1.

الجدول 1. معلومات المنتج

6. فيما يتعلق بالقراءة

الحل لإعداد مكتبة NGS من عينات الحمض النووي

ما مدى معرفتك بالتكنولوجيا المتعلقة بـ NGS؟