يلعب محول الجيل التالي للتسلسل، وهو جزء أساسي من مكتبة التسلسل من الجيل التالي، دورًا في ربط شظية الحمض النووي المختبرة بخلية التدفق (شريحة التسلسل). تعد كفاءة المفصل عاملاً مهمًا في تحديد جودة المكتبة وإنتاجيتها. إذن ما هو محول الجيل التالي للتسلسل؟ ما هي الأنواع الشائعة لمحولات الجيل التالي للتسلسل؟ وكيف تختار محولات الجيل التالي للتسلسل المناسبة لمنصات التسلسل الخاصة بك؟

1. ما هو محول NGS؟

2. ما هي العوامل التي يجب مراعاتها عند اختيار مؤشر NGS؟

3. ما هي أنواع المؤشرات الشائعة؟

4. ما هي الأنواع الشائعة لمحولات NGS؟

• محول UMI
• محولات كاملة
• محولات غير مكتملة
• محولات Tn5

5. كيفية اختيار محولات NGS المناسبة لمنصات التسلسل الخاصة بك؟

6. بخصوص القراءة

1. ما هو محول NGS؟

محول NGS، وهو عبارة عن سلسلة من المحولات في التسلسل، عبارة عن تسلسل نيوكليوتيدي قصير بتسلسل معروف. وهو مرتبط بكلا طرفي شظية الحمض النووي المستهدفة. أثناء التسلسل، يبدأ التسلسل عن طريق التهجين مع التسلسل المعروف في خلية التدفق لدمج المكتبة في الشريحة. إذن ما هي بنية محول NGS؟

باستخدام منصة Illumina كمثال، يمكن تقسيم محول NGS إلى ثلاثة أجزاء:

P5 وP7: تم دمج التسلسل مع نهايتي P5 وP7 على خلية التدفق لتثبيت المكتبة على شريحة التسلسل، مما يسهل تفاعل المجموعة من خلال Bridge-PCR.

Rd1 SP وRd2 SP (بادئ التسلسل Read1/Read2): مناطق ربط بادئات التسلسل، تشير إلى الموضع الذي يبدأ عنده قراءة التسلسل.

الفهرس (المعروف أيضًا باسم الرمز الشريطي): تسلسل اصطناعي معروف يستخدم للتمييز بين العينات المختلفة في تسلسل المكتبة المختلطة.

تين. 1 مكتبة فهرس واحدة لمنصة Illumina

تين. 2 مكتبة الفهرس أحادية النهاية لمنصة MGI

مع زيادة معدل التسلسل، يمكن تسلسل عينات متعددة في نفس الوقت. لذا فإن كيفية التمييز بين العينات المتنوعة مهمة بشكل خاص. وكما ذكرنا سابقًا، تُستخدم تسلسلات الفهرس لمحول الجيل التالي للتمييز بين العينات المختلفة في تسلسل الجيل التالي (NGS). ما العوامل التي يجب مراعاتها عند اختيار الفهرس؟ يرجى الاستمرار في القراءة...

2. ما هي العوامل التي يجب مراعاتها عند اختيار المؤشر؟

يبلغ طول المؤشر عادة 6nt-18nt وينقسم إلى مؤشر واحد ومؤشر مزدوج وفقًا لعدد المؤشرات. يقع المؤشر المزدوج عند كلا طرفي القطعة المراد اختبارها. يجب مراعاة توازن القاعدة وتوازن الفلورسنت عند اختيار مجموعة المؤشرات.

يشير التوازن الأساسي إلى التوازن بين مؤشرات متعددة، وليس التوازن الأساسي في مؤشر واحد. يجب النظر إليه من كل من أنواع القاعدة وتوزيع القاعدة. مبدأ الجمع هو أنه يجب تضمين القواعد الأربع A/T/C/G في نفس مجموعة المؤشرات، ونسبة هذه القواعد الأربع متقاربة، حيث تمثل حوالي 25% على التوالي.

يشير توازن إشارة الفلورسنت إلى الاختيار لضمان توازن إشارات الفلورسنت عندما لا يمكن ضمان التوازن الأساسي. في جهاز التسلسل رباعي القنوات في منصة Illumina، يتم تمييز dG/dT بفلورسنت أخضر، ويتم تمييز dC/dA بفلورسنت أحمر. أثناء التسلسل، يجب أن توجد إشارات الفلورسنت الخضراء والحمراء في كل دورة لضمان التسلسل الناجح. لذلك، ينبغي أن يؤخذ بعين الاعتبار التوازن بين الإشارة الخضراء والإشارة الحمراء عند اختيار المؤشر.

3. ما هي أنواع المؤشرات الشائعة؟

تشتمل الفهارس المزدوجة الشائعة عادةً على فهرس مزدوج فريد (UDI)، ورمز شريطي مزدوج فريد (UDB)، وفهرس مزدوج مشترك (CDI)، مما يقلل بشكل كبير من التنقل بين الفهارس والتعيين الخاطئ.

UDI&UDB: المؤشرات في كلا الطرفين متوافقة واحد لواحد، ومصممة في مجموعات، ويمكن التحقق منها بشكل متبادل في كلا الطرفين؛

طقم تمهيدي UDI قصير لـ Illumina مقدم من Yeasen (رقم الصنف 12404ES/12405ES)>>

CDI: يمكن دمج الفهارس في كلا الطرفين وفقًا لمتطلبات معينة لتشكيل مكتبة فهرس ذات طرفين؛

فتيل 384 CDI لـ Illumina، Set1-Set2 تم توفيره بواسطة Yeasen (رقم الكتالوج12412ES/12413ES)>>

من أجل تحسين الإنتاجية وكفاءة التضخيم وتقليل تكلفة التسلسل، قدمت Illumina تقنية تجميع خلية التدفق المصفوفة (PFCT) والتضخيم الحصري (ExAmp) لـ Novaseq وغيرها من أجهزة التسلسل عالية الإنتاجية ولكنها قامت عن غير قصد بتضخيم ظاهرة عدم تطابق تسمية العينة والقفز بين المؤشرات.

الشكل 3 تعتمد نماذج أجهزة Illumina المختلفة على خلية تدفق غير منقوشة أو خلية تدفق منقوشة

من أجل تعويض مشكلة تقاطع الفهرس التي أبرزتها منصات التسلسل مثل HiSeq3000/4000 وHiSeq X Series وNovaSeq، اقترحت Illumina استراتيجية وضع الفهرس على طرفي المكتبة، والتي يمكنها إجراء التحقق الثنائي والقضاء على المحولات غير المتطابقة. عند استخدام الفهارس الفريدة على كلا الطرفين، سيتم تقليل معدل تخصيص خطأ الفهرس إلى 0.01%. بالمقارنة مع طريقة مجموعة تبديل الفهرس التقليدية السابقة، سيتم تقليل تقاطع الفهرس بمقدار مرتبتين من حيث الحجم.

في بناء مكتبة خالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل، يتوفر محول فهرس أحادي الطرف. يحدث عدم تطابق العلامات بشكل أساسي بسبب أخطاء التسلسل. بشكل عام، يكون معدل عدم تطابق العلامات منخفضًا (متوسط ​​0.0004%، حتى 0.001%). ومع ذلك، في بناء مكتبة التقاط مستهدفة، تتضخم مشكلة التداخل لأن الخطوات المتعددة ستؤدي إلى عدم تطابق العلامات وعادةً ما يتم استخدام محولات UDI/UDB/CDI.

4. ما هي الأنواع الشائعة لمحولات NGS؟

مع تطور تقنية التسلسل، ظهرت أنواع أكثر فأكثر من المحولات، مثل محولات الفهرس الفردي/الفهرس المزدوج (كما ذكر في القسم 3)، ومحولات UMI، ومحولات الترانسبوزاز، والمحولات الكاملة/غير الكاملة، وما إلى ذلك، والتي تناسب مجموعة متنوعة من سيناريوهات التطبيق. يقوم هذا الجزء بفرز هذه المحولات بشكل منهجي لإعطائك الأساس لاختيار المحول.

محول UMI 4.1

محول المعرف الجزيئي الفريد (UMI) هو أداة متطورة للكشف عن الطفرات منخفضة التردد والقياس الكمي المطلق. محول المعرف الجزيئي الفريد (UMI) عبارة عن تسلسل اصطناعي عشوائي بتسلسل معروف. يمكن تصميمه كسلسلة نوكليوتيدات عشوائية تمامًا أو سلسلة نوكليوتيدات متحللة جزئيًا أو سلسلة نوكليوتيدات ثابتة.الطول عادة ما يكون 10nt (UMI أحادي النهاية) أو 5-8nt (UMI ثنائي النهاية). وظيفتها هي تجميد حالة شظايا الحمض النووي قبل التضخيم، وكل جزيء DNA يتوافق مع UMI. لذلك، أثناء تحليل المعلوماتية الحيوية، يمكنه التمييز بين قوالب الحمض النووي من مصادر مختلفة، والتمييز بين الطفرات الإيجابية الكاذبة الناجمة عن أخطاء عشوائية في عملية تضخيم وتسلسل تفاعل البوليميراز المتسلسل، والتي يحملها المرضى بالفعل، وذلك لتصفية الضوضاء الخلفية، وتحقيق الكشف الدقيق عن الطفرات منخفضة التردد ومنخفضة التردد للغاية، وإجراء تقدير مطلق لجزيئات الحمض النووي المختلفة. يستخدم على نطاق واسع في الكشف عن الطفرات منخفضة التردد، وخاصة في مجال أبحاث الأورام.

الشكل 4 مخطط تخطيطي لمحول UMI هيكل منصة Illumina

4.2 المحولات الكاملة

تحتوي المحولات الكاملة، وهي منتج ضروري لمكتبة خالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل، على جميع التسلسلات المطلوبة للتسلسلات، مثل P5 وP7 وRdS1 وRdS2 في منصة Illumina، كما تفهرس التسلسلات وتسلسلات UMI وفقًا لمتطلبات التسلسل. باستخدام المحولات الكاملة، يمكن تسلسلها مباشرة دون إدخال محولات أخرى من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل. لذا، يمكن استخدام المحولات الكاملة لبناء مكتبة خالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن للمكتبات الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل تقليل تحيز تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ومعدل الخطأ وتكرار التسلسل، مما يزيد من تغطية بعض مناطق GC أو AT العالية المستخدمة على نطاق واسع في أبحاث الجينوم السكاني.

منتج محول كامل لمنصة Illumina من إنتاج Yeasen (رقم الفئة 13519ES/13520ES)>>

منتج محول كامل لمنصة MGI المقدمة من Yeasen (رقم الفئة 13360ES/13361ES)>>

الشكل 5 مخطط المحول الكامل

4.3 محولات غير مكتملة

تحتاج المحولات غير المكتملة إلى إدخال تسلسلات أخرى عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل بعد ربط المحول لتشكيل محول كامل. تتميز بكفاءة اتصال عالية ومعدل مكتبة فعال مرتفع. تعد عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل بمثابة تأثير إثراء للمكتبة الكاملة لضمان تركيز المكتبة الفعالة، ويمكنها أيضًا إدخال فهرس مزدوج النهاية وتسلسلات UMI.

4.4 محولات Tn5

تقوم محولات Tn5 بربط جزء من تسلسل المحول بكلا طرفي شظايا الحمض النووي من خلال نشاط نوكلياز القيد لـ Tn5. وهي تجعل التفتيت وربط المحول يتم في وقت واحد لتوفير الوقت والعينات. وأخيرًا، يتم تقديم بقية تسلسل الرابط والفهرس وUMI والتسلسلات الأخرى بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل لتشكيل مكتبة كاملة. ويمكن استخدامها لبناء مكتبة Cut&tag.

الشكل 6 مخطط تخطيطي لبناء مكتبة محول Tn5

5. كيفية اختيار محولات NGS المناسبة لمنصات التسلسل الخاصة بك؟

يوجد حاليًا منصتان رئيسيتان للتسلسل، بما في ذلك Illumina وMGI. قامت شركة Yeasen، وهي شركة تقدم حلولاً كاملة لمزودي NGS، بتطوير محولات NGS متعددة مناسبة لمنصات Illumina أو MGI.

من حيث منصة Illumina، تحتوي محولات Illumina NGS التي توفرها Yeasen على ثلاثة أنواع، بما في ذلك UDI وCDI ومؤشر واحد. من حيث منصة MGI، تحتوي محولات MGI NGS التي تقدمها Yeasen على نوعين، يتضمنان Dual UMI -UDB ومؤشر واحد.لقد قمنا بإدراج معلومات المنتج في الجدول التالي، بما في ذلك أنواع المحولات، والأحجام المتوفرة، وتركيز المحول والبرايمر، على التوالي.

لا داعي للقلق بشأن مشاكل التوصيل مع محولات UDI NGS الكاملة، وهي مناسبة للعملاء الذين يريدون سهولة الاستخدام؛ تحتوي محولات CDI NGS على عدد أقل من الأنابيب وحجم صغير، وهي مناسبة للعملاء الذين يريدون التخزين والحمل بسهولة. تتطلب PCR-free استخدام محولات NGS الكاملة.

لإلومينا

ان تيوب	هييف NGS® دإعداد مكتبة أمريكا الشمالية 384 CDI Primer لـ Illumina، المجموعة 1 (8*12، مؤشر 96)	12412ES
	هييف NGS® دإعداد مكتبة أمريكا الشمالية 384 CDI Primer لـ Illumina، المجموعة 2 (8*12، مؤشر 96)	12413ES
	مجموعة تمهيدية Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI لـ Illumina، المجموعة 1 (فهرس 96)	12414ES
	مجموعة تمهيدية Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI لـ Illumina، المجموعة 1 (فهرس 96)	12415ES
في طبق	طقم برايمر Hieff NGS® Stubby UDI لـ Illumina (مؤشر 1-384) المجموعة 1-4	12407ES
	طقم برايمر Hieff NGS® Stubby UDI لـ Illumina المجموعة 1(لوحة 96 بئر، فهرس 1-96) المجموعة 1	12327ES
	طقم برايمر Hieff NGS® Stubby UDI لـ Illumina المجموعة 2(لوحة 96 بئر، 97-192 فهرس) المجموعة 2	12328ES
	طقم برايمر Hieff NGS® Stubby UDI لـ Illumina المجموعة 3(لوحة 96 بئر، 193-288 فهرس) المجموعة 3	12329ES
	طقم برايمر Hieff NGS® Stubby UDI لـ Illumina المجموعة 4(لوحة 96 بئر، 289-384 فهرس) المجموعة 4	12330ES

بخصوص القراءة

الإنزيمات الرئيسية المشاركة في بناء مكتبة NGS

ما مدى معرفتك بالتكنولوجيا المتعلقة بـ NGS؟

أنواع مختلفة من الخرز المغناطيسي في الجيل التالي من التسلسل: الخرز المغناطيسي DNA\RNA\mRNA

تحديد كمية مكتبة NGS: Qubit سريع ودقيق أو qPCR دقيق؟ ​​كل ما هو مطلوب!