1. انخفاض إنتاج النسخ

ترتبط جودة القالب ارتباطًا وثيقًا بالعائد. إذا كان العائد للمجموعة التجريبية أقل بكثير من المجموعة الضابطة، فإن الأسباب المحتملة هي:

① القالب التجريبي يحتوي على مكونات مثبطة؛

② القالب به خطأ ما.

الاقتراحات:

① إعادة تنقية القالب؛

② تحديد كمية القالب وسلامته؛

③ تمديد وقت رد الفعل؛

④ زيادة كمية إدخال القالب؛

⑤ حاول استخدام مُحفِّزات أخرى وبوليميرازات الحمض النووي الريبي.

2. انخفاض إنتاج النصوص القصيرة

إن شظية بدء النسخ القصيرة سوف تمنع التفاعل. وعندما يكون ناتج النسخ أقل من 100 nt، فإن تمديد وقت التفاعل إلى 4-8 ساعات أو زيادة كمية القالب إلى 2 ميكروجرام سوف يزيد من إنتاج الحمض النووي الريبي.

3. طول نسخ الحمض النووي الريبي أكبر من المتوقع

إذا أظهر التحليل الكهربائي أن شريط المنتج أكبر من الحجم المتوقع، فإن الأسباب المحتملة هي:

①قد لا يكون قالب البلازميد خطيًا تمامًا؛

②الطرف 3' من خيط الإحساس له بنية بارزة؛

③يحتوي الحمض النووي الريبوزي RNA على بنية ثانوية ليست مشوهة تمامًا.

الاقتراحات:

①تحقق مما إذا كان القالب خطيًا تمامًا، وإذا لزم الأمر، قم بإجراء خطية إضافية؛

②اختر إنزيم تقييد مناسب لتجنب تجاوزات 3'، أو استخدم بوليميراز الحمض النووي Klenow Fragment /T4 لإكمال النسخ قبل المتابعة؛

③استخدم الجل المغير للكشف عن منتجات الحمض النووي الريبي.

4. طول نسخ الحمض النووي الريبي أقل من المتوقع

إذا أظهر التحليل الكهربائي أن شريط المنتج أصغر من الحجم المتوقع، فإن الأسباب المحتملة هي:

①يحتوي القالب على تسلسل إنهاء مشابه لبوليميراز RNA T7؛

②محتوى GC في القالب مرتفع.

الاقتراحات:

①خفض درجة حرارة التفاعل (على سبيل المثال، 30 درجة مئوية). في بعض الأحيان قد يؤدي خفض درجة الحرارة إلى زيادة طول النسخ، لكنه سيقلل من العائد. أو جرب بوليميرات RNA مختلفة للنسخ؛

②إذا كان محتوى GC في القالب مرتفعًا، استخدم 42 درجة مئوية للنسخ، أو إضافة SSB لزيادة العائد وطول النسخ.

5. ذيل الرحلان الكهربائي لمنتجات النسخ

هناك ظاهرة الذيل أثناء التحليل الكهربائي.

الأسباب المحتملة:

①ملوثة بـRNase أثناء التشغيل التجريبي؛

②قالب الحمض النووي الملوث بواسطة RNase.

الاقتراحات:

①استخدم أطراف الماصة وأنابيب EP الخالية من RNase، وارتدِ قفازات وأقنعة اللاتكس التي تُستعمل لمرة واحدة، ويتم تحضير جميع الكواشف باستخدام H2O الخالي من RNase.

②إعادة تنقية قالب الحمض النووي.

[1] دونغ زي، زينج إن، هو سي، وآخرون.يزيد الحمض النووي الريبوزي الشبيه بالميكروRNA 8 (Nb-milR8) من قدرة الفطريات المسببة للأمراض عن طريق تعديل التعبير الجيني لجين BmPEX16 في مضيفها Bombyx mori. Microbiol Spectr. 2021؛9(2):e0104821. doi:10.1128/Spectrum.01048-21(IF:7.171)

[2] Wang X، Tang S، Ye S، وآخرون. القياس الكمي فائق الحساسية لـ miR-195-5p المتداول باستخدام سلسلة تضخيم إزاحة ثلاثية الخيوط. Talanta. 2022؛ 242: 123300. doi: 10.1016/j.talanta.2022.123300(IF: 6.057)