هييف^™ خلية سريعة مباشرة مجموعة RT-qPCR المستندة إلى صبغة SYBR Green مناسبة لاستخراج الحمض النووي الريبي من جميع أنواع الخلايا الحيوانية (مثل خلايا جدار الخلية وخلايا التعليق وخلايا الثقافة الأولية والخلايا الجذعية المختلفة وخلايا iPS وما إلى ذلك)، دون الحاجة إلى استخراج الحمض النووي الريبي، ويمكن استخدامها مباشرة لتحليل تعبير qPCR، وهي قصيرة وسهلة التشغيل ولديها معدل خطأ منخفض. يستغرق الأمر 1.5 ساعة فقط لإكمال الخطوات من تحضير القالب إلى تفاعل النسخ العكسي وتحليل التعبير الجيني.

تشتمل المجموعة على كواشف النسخ العكسي والكشف عن الفلورسنت، والتي يمكن استخدامها لتحليل التعبير الجيني دون الحاجة إلى شراء كواشف إضافية.

تحديد

عناصر

تخزين

تم إذابة محلول تحلل FCD ومحلول الغسيل FCD وتخزينهما عند 4 درجات مئوية لمنع التلوث. يجب تخزين محلول FCD Stop وDNase I و4 × Hifair™ FCD RT Mix و2 × Hieff™ FCD qPCR SYBR Master Mix في درجة حرارة -25~-15 درجة مئوية.

تعليمات

1. تحضير منتجات الانقسام

1)1. قم بتذويب الكاشف في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بقلبها رأسًا على عقب واخلطها بلطف قبل الاستخدام، واستخدمها بعد الطرد المركزي الخفيف لتجنب الرغوة*.

*عدم القدرة على خلط الكواشف، واستخدام مذبذب للخلط، وعدم القدرة على تكوين الكواشف على الجليد يمكن أن يؤدي إلى انخفاض في أداء التفاعل.

2) اعتمادًا على نوع الخلية**، انقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي وقم بتشغيله بسرعة 5000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين لجمع الخلايا وشفط الوسط جيدًا. إذا تمت زراعة الخلايا في أطباق ذات 96 بئرًا، فيمكن شفط الوسط مباشرةً.

3) أضف 150 ميكرولترًا من محلول الغسيل FCD إلى كل بئر، ثم اغسل الخلايا بالنفخ، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 5000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين، ثم قم بسحب محلول الغسيل FCD***.

4) أضف 48 ميكرولترًا من محلول FCD Lysis Buffer و2 ميكرولتر من محلول DNase 1 إلى كل بئر، ثم انفخ واخلط في درجة حرارة الغرفة، ثم اتركه لمدة 5 دقائق، ثم أضف 2.5 ميكرولتر من محلول FCD Stop بعد الحضانة****، ثم يتم النفخ والخلط لمدة 5 مرات تقريبًا للحصول على منتج الانشطار*****.

** المتطلب الأساسي لعدد الخلايا هو 1 × 10⁴ خلايا لكل بئر، ويمكن استخدام هذه المجموعة في نطاق 1 × 10³ - 1 × 10⁶ الخلايا. إذا كان عدد الخلايا أكبر، يمكن زيادة كمية محلول FCD Lysis Buffer ومحلول DNaseⅠ بشكل متناسب حسب الاقتضاء.

*** تختلف ظروف الطرد المركزي من خلية إلى أخرى، لذا يرجى إجراء الطرد المركزي بسرعة مناسبة للخلايا المستخدمة.

**** أضف 2.5 ميكرولترًا من محلول FCD Stop إلى 50 ميكرولترًا من المحلول المحلول، وزد كمية محلول FCD Stop حسب الحاجة.

***** للتخزين طويل الأمد لمحاليل منتجات تحلل الخلايا، ضعها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

5) قم بتذويب 4 × مزيج Hifair™ FCD RT في درجة حرارة الغرفة واخلط مع قلب طفيف، ثم ضعه على الثلج وقم بتكوين نظام التفاعل وفقًا للجدول أدناه:

*******مستوى الاستخدام الموصى به هو 2-5 ميكرولتر، حاول ألا تتجاوز 45%.

1. النسخ العكسي

استخدم الماصة واخلط بلطف محلول التفاعل المحضر أعلاه وقم بإجراء تفاعل النسخ العكسي وفقًا للإجراء الموضح في الجدول أدناه:

* درجة حرارة النسخ العكسي الموصى بها هي 55 درجة مئوية. بالنسبة للقوالب ذات المحتوى العالي من GC أو القوالب المعقدة، يمكن زيادة درجة حرارة النسخ العكسي إلى 60 درجة مئوية. يمكن استخدام منتج النسخ العكسي مباشرة للكشف عن RT-qPCR في اتجاه مجرى النهر. لتجنب تثبيط تفاعل qPCR بواسطة نظام النسخ العكسي والحصول على قيمة Ct المناسبة (10-35)، يمكن تخفيف المنتج 10-1000 مرة ثم استخدامه. إذا لم يتم إجراء التجارب اللاحقة لفترة قصيرة، يمكن وضعه في درجة حرارة -20 درجة مئوية للتخزين.

1. تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري

1) رد الفعل نظام إعدادات

يوصى بالنسب التالية لإعداد محلول التفاعل (التحضير على الجليد).

*لا تضف أكثر من 1/10 من حجم RT-qPCR لمنتج النسخ العكسي. سيؤدي التركيز العالي للقالب بسهولة إلى تضخيم غير محدد، التخفيف المناسب من 5 إلى 50 مرة. الكمية الموصى بها من القالب هي 4 ميكرولتر، حاول ألا تتجاوز 6 ميكرولتر. عندما يكون أداء التفاعل ضعيفًا، يمكن تعديل تركيز البادئ في نطاق 0.2-1.0 ميكرومول/لتر.

2) إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري (طريقة من خطوتين)

3) إجراء التضخيم السريع لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري (طريقة من خطوتين)

* يمكن تعديل درجة حرارة التلدين/التمديد ووقت التمديد النهائي بشكل مناسب وفقًا للمتطلبات التجريبية. البرنامج السريع مناسب لمعظم الجينات، ويمكن تجربة البرنامج القياسي للجينات الفردية ذات البنية الثانوية المعقدة.

ملحوظات

1. هذا المنتج مخصص للاستخدام البحثي فقط.
2. يرجى العمل باستخدام معاطف المختبر والقفازات التي تستخدم لمرة واحدة، من أجل سلامتك.

الإصدار EN20230908

وثائق:

الدليل

11172-Hieff™ Fast Cell Direct. EN20230908.pdf